水稻秸秆微贮制备饲料的试验

李 骅,赵汝东,李 超,吴 鑫,刘玉涛,丁 想

（南京农业大学 工学院，南京210031）

我国是农业大国，秸秆资源丰富，每年秸秆总产量高达8.9 亿t，是秸秆产量最多的国家[1-2]，其中水稻秸秆在农作物秸秆中占30%，约为2.7 亿t[3]。随着我国农村地区经济快速发展以及居民燃料消费结构发生改变，同时农作物秸秆产量不断增加，而秸秆高值化资源化利用率偏低，广大农村地区仍有大量秸秆作为废弃物在田间焚烧导致环境污染[4-8]。秸秆饲料化作为一种秸秆综合利用方式能解决污染问题，提高农业生产附加值，为农民增收，每吨秸秆进行饲料化利用带来的经济效益约为700 元[9]，因此秸秆饲料化具有广阔的发展前景。目前秸秆饲料化处理的主要方法有物理处理、化学处理和生物处理[10-11]。物理处理法包括切短、粉碎、蒸煮以及热喷等，可破坏秸秆纤维结构，使秸秆变得松软；化学处理法包括碱化和氨化法，可破环秸秆物理结构，提高动物消化率，但处理过程使用的试剂会对环境造成污染；生物处理法是在处理后的秸秆中加入有益菌剂进行发酵，可以改变秸秆物理性状，使其变得松软，提高采食速度和适口性，还可增加营养物质，而且不会对环境造成污染，所以成为目前处理秸秆的首选途径。

祁宏伟等[12-13]研究发现破坏秸秆蜡质层可更利于微生物发酵；杨旭等[14-16]发现植物乳杆菌在微贮发酵秸秆时为优势菌，可以有效抑制腐败菌生成；高丽娟等[17-18]发现外源乳酸菌有益于稻草秸秆发酵。国内秸秆饲料化研究多聚焦菌剂种类对发酵效果的影响[19]，而秸秆含水率、长度等因素对于工艺的产业化有关。因此，本研究以添加菌种比例、菌剂添加量、含水率、秸秆长度为考察因素，以秸秆发酵质量得分为评价指标，探究水稻秸秆微贮发酵制备动物饲料的最优工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2019 年11 月在南京农业大学浦口校区（118.7°E，32.1°N）内进行，稻秆为南粳5055 水稻秸秆，经自然风干后使用。试验使用的3种菌种购买于北京北纳创联生物技术研究院。酸标准液、指示剂、盐酸等主要试剂均为分析纯，采购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验 设置四个单因素变量（植物乳杆菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢杆菌添加比例、菌剂添加量、含水率、秸秆长度）。在常规秸秆发酵试验中[20]，菌剂添加量通常在0.30%，含水率通常控制在50%，动物进食长度通常在3cm[21]，在此基础上每个因素取五个水平进行单因素试验，每个处理3次重复，具体试验变量及参数如表1。

表1 单因素试验设计Table 1 Single factor experiment

1.2.2 正交试验 根据单因素试验的数据分析结果设计四因素四水平正交试验，每个处理3次重复，试验设计如表2。

表2 正交试验设计Table 2 Design of orthogonal experimental

1.3 试验步骤

利用MRS 培养基、营养肉汁琼脂培养基、综合PDA 琼脂培养基分别接种植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母，在28～30℃的振荡器中培养2～10d；按每1kg 水加入10g 白糖用于提供营养物质。选取未霉变的秸秆，利用带刻度剪切板将秸秆切割至1，2，3，4，5cm 备用；每组称取50g秸秆，根据各组菌剂添加量以及菌剂配比加入3 种菌液，根据含水率添加蒸馏水，添加食盐（0.8%）促进菌种繁殖，添加尿素（2%）作为氮源供菌种合成蛋白质，然后与秸秆混合均匀后放入食品保鲜袋中，利用真空封口机抽出保鲜袋空气并密封，放到恒温箱中25℃发酵28d。

1.4 数据检测及处理

挥发性脂肪酸测定采用Agilent7820A 气相色谱仪，配备FID 检测器，Agilent122-7032 色谱柱。色谱条件：进样口温度240℃；柱温初始50℃，保持5min，最终达到250℃，保持4min；检测器温度为250℃；气体流速：载气（氮气≥99.99%）25mL·min-1；氢气≥99.99%，30mL·min-1；空气，400mL·min-1，进样量为0.5uL。氨态氮测定采用水杨酸钠—次氯酸钠法[22]；粗蛋白测定采用GB/T6432-94 凯氏定氮法[23]；纤维成分测定采用范氏（Van Soest）法[23]；粗脂肪测定采用GB6433-1994 索氏抽提法[24]；黄曲霉毒素测定采用黄曲霉素试纸方法[25]。 采用Excel 2010和Origin 9.1对数据进行处理以及图表的绘制，SPSS 20.0对数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

由图1a可知，菌种配比对挥发性脂肪酸含量变化影响较小，而氨态氮波动较大，可选取氨态氮含量较低的菌种组合进行正交试验，故选取植物乳杆菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢杆菌添加比例1∶1∶1，2∶1∶1，2∶2∶1，2∶1∶2 四个水平进行正交试验。由图1b 可知，当菌剂添加量在0.15%～0.25% 时挥发性脂肪酸及氨态氮含量波动较大，且当添加量为0.2% 时乳酸含量最高，乙酸、丁酸、丙酸及氨态氮的含量最低，故在0.20% 两侧选取0.10%、0.15%、0.20%、0.25% 四个水平进行正交试验。由图1c可知，当含水率在50%～70% 时各项指标变化显著，且在60% 时，正向指标乳酸含量最高，其余负向指标含量最低，因此取50%、55%、60%、65% 为正交试验四个水平。由图1d 可知，当秸秆长度在2～4cm 时乳酸含量最高，乙酸含量最低，而其余指标波动较小，因此以乳酸及丁酸含量作为判断依据，并考虑到长度对动物进食影响[21]，故选2，3，4，5cm进行正交试验。

2.2 正交试验分析

采用L16（44）正交试验确定水稻发酵秸秆制备生物饲料的最佳参数。表2 为正交试验处理参数，表3 为综合评分计算结果。以青贮饲料质量评定标准[26]作为评定体系，该体系采用有机酸评分与氨态氮评分结合的方法，先将有机酸评分除以2，然后与氨态氮得分相加，即可获得综合评分。由表3 可知，乙酸值处于5.1%～8.4%之间，对综合评分无影响，正向指标乳酸和负向指标丁酸的波动对综合评分影响较大。本试验运用综合平衡分析法，首先找出各指标最优水平，列出对各指标的主次因子顺序然后综合平衡，找出最优的因素水平。

表3 正交试验各处理综合评分计算结果Table 3 Orthogonal test each processing comprehensive score calculation result

由表4 可知，Ki值最大为最优水平。A 因素最优为K3A和K4A，B 因素为K3B，C 因素为K3C，D 因素为K2D，即为A3B3C3D2和A4B3C3D2为理论上的最优水平组合。在评分最佳组Z8（A2B4C3D2）与Z14（A4B3C3D1）中，植物乳杆菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢杆菌分别为2∶1∶2 与2∶2∶1。由于啤酒酵母菌蛋白质含量高，较多的啤酒酵母菌可提供更多的营养蛋白，而过多的枯草芽孢杆菌会抑制菌剂繁殖，结合K4A（2∶2∶1）为理论最优水平，所以最佳菌种比例取2∶2∶1；菌剂添加量的理论最优值为K3B（0.2%）；含水率的理论最优值为K3C，与试验最优评分组水平一致，即最优含水率为60%；K2D（3cm）为理论最优秸秆长度，结合图1d，当秸秆长度为3cm时的指标要优于2cm发酵指标，而且秸秆越短需要消耗更多粉碎功率，所以3cm为最优秸秆长度。综上得到秸秆发酵最优工艺参数：添加菌种比例2∶2∶1，菌剂添加量0.20%，含水率60%，秸秆长度3cm。通过表4中的极差R分析，四个因素对指标的影响排序为：秸秆长度＞含水率＞添加菌种比＞菌种添加量。

表4 正交试验秸秆质量评分极差分析Table 4 Analysis of orthogonal experimental straw quality score

图1 多因素变量对挥发性脂肪酸中各酸占比的影响Figure 1 Effect of multi-factor variables on the proportion of each acid in volatile fatty acids

2.3 理论最佳发酵条件验证

最佳发酵条件为：菌剂添加量0.20%，秸秆长度3cm，含水率60%，植物乳杆菌、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌比例为2∶2∶1，由于理论最佳条件不在正交试验组内，对其进行发酵试验验证。试验地点在南京农业大学浦口校区，开始于2019年12月12日，样品放置到恒温箱中以25℃发酵28d。

2.3.1 饲料质量分析 正交试验最优评分为：综合评分74，VFA 48，氨态氮50。由表5可知，氨态氮含量普遍比正交试验内的最优组稍高，所以氨态氮评分稍低，但是挥发性脂肪酸的含量成分较好，VFA得分普遍比正交试验内的最优组高，综合评分分别为75.5，75，73。只有一组稍低于正交试验最优组的74分，所以正交试验结果可靠。

表5 贮存性能指标Table 5 Index of storage performance

2.3.2 营养指标分析 由表6可知，相对于未处理秸秆，发酵秸秆的蛋白质含量最高提升至9.13%，差异显著（p＜0.05），但与天然牧草[27]仍有差距；粗脂肪含量相对于普通秸秆减少，原因是在微贮过程中，由于挥发性脂肪酸的消耗，导致了粗脂肪含量的减少[28]；粗纤维的含量相对于未处理秸秆也有少量的减少，其主要原因是由于选定的菌种对纤维素的分解作用不明显。

表6 营养指标变化Table 6 Changes in nutritional indicators

2.4 微贮秸秆结构变化分析

由图2（卡尔·蔡司SIFMA300 1k 倍电镜扫描）可知，自然风干的水稻秸秆外表面有小幅度的凹凸，且布满颗粒状凸点，内表面呈现光滑平整的状态。而微贮后的水稻秸秆存在明显的差异，外表面的光泽度明显下降，主要原因是发酵过程中秸秆外表面蜡质层被部分去除，内外表面有明显的撕裂、破坏，同时存在有片状脱落及分层的倾向，且发酵后秸秆变得松软。

图2 微贮处理秸秆内外表面结构变化Figure 2 Changes of internal and external surface structure of straw after micro-storage micro-storage

2.5 微贮秸秆安全性分析

国标中对于青贮以及微贮秸秆饲料无黄曲霉素标准具体要求[29]，参考玉米花生饼以及豆粕的要求（玉米花生饼，黄曲霉毒素含量＜50μg·kg-1；豆粕，黄曲霉毒素含量＜30μg·kg-1），以残留限量20μg·kg-1为标准，对发酵样品利用黄曲霉毒素检测试纸测得结果阴性，表明微贮发酵后饲料黄曲霉毒素B1浓度小于检测限20μg·kg-1，符合饲料安全标准。

3 讨论与结论

秸秆饲料化是一种高值的秸秆综合处理方式，但目前由于一系列技术问题尚未得到解决，导致我国秸秆饲料化进程尚未得到较为突出的进步。数据表明，发达国家如美国的秸秆综合利用率达到90%，英国达到70%，韩国水稻秸秆的饲料化利用率达到80% 以上，而目前我国秸秆饲料化利用率仅占可收集资源量的20%[30]，秸秆饲料化在我国具有广阔的发展前景。

本研究利用试验得出的最优参数对水稻秸秆进行微贮发酵处理，分析其营养成分发现秸秆粗蛋白含量由5.16% 最高提升至9.13%，蛋白质变化显著（p＜0.05），这与徐焱等[31]研究结果一致，虽然粗蛋白有显著提升，但低于天然牧草粗蛋白含量，分析其原因是由于在发酵过程中含有粗蛋白的酵母菌大量繁殖提升了饲料粗蛋白含量，但提供的数量有限，为解决这一问题可以在微贮时添加一些农副产品比如豆粕、麸皮等来进一步提高粗蛋白含量。粗纤维含量虽有小幅度下降但是差异不显著（p＞0.05），主要原因是试验中添加的啤酒酵母菌对纤维素的分解作用较小，而像白腐真菌[32]这种对纤维素分解能力较强，但由于其生存环境与试验中的菌种的环境差异较大而未添加。试验中经过微贮过的秸秆变得松软有酵香，有利于改善动物适口性，提高进食效率，这与刘兴义等[33]研究结果一致。由于试验是单包少量试验，未能进行喂养试验。

本研究利用单因素试验及四因素四水平正交试验得到了水稻秸秆微贮发酵理论最佳参数：菌比2∶2∶1（植物乳杆菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢杆菌），菌剂添加量0.20%，含水率60%，秸秆长度3cm。对各个因素影响秸秆饲料质量评分的结果进行极差分析可得出对秸秆饲料质量评分影响大小顺序为：秸秆长度＞含水率＞菌比＞菌种添加量，试验结果可为水稻秸秆微贮制备动物饲料产业化提供参考。