小地老虎化学感受蛋白AipsCSP2配体结合特性分析

饶福强，苏 旭，李仔博，耿 亭，张永军，宋 萍，谷少华

（1.河北农业大学植物保护学院，保定 071000；2.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.农业农村部廊坊作物有害生物科学观测实验站，廊坊 065000；4.中国农业大学昆虫学系，北京 100193）

小地老虎Agrotisipsilon(Hufnagel)属于鳞翅目夜蛾科昆虫，别名土蚕、切根虫等[1]，其主要为害蔬菜、玉米、高粱、棉花、烟草等作物幼苗，切断幼苗近地面的茎部，使整株死亡，造成缺苗断垄，甚至毁种[2]，是全国性的重要农业害虫[3]。

昆虫在长期进化过程中，发展演变出复杂的化学信息感受机制，高度发达的化学感受系统对昆虫与环境中的化学信息联系具有重要作用[4]。如昆虫在觅食、求偶、交配、繁殖、防御、迁徙等行为中，通过敏锐的嗅觉、味觉、触觉等功能，感受各种环境化学因子的刺激，从而进行精巧的化学通信，以适应环境选择，保持种群繁衍[5]。

目前，在昆虫的化学感受器官淋巴液中已经发现两类水溶性蛋白能够作为气味分子和化学刺激物的载体，一类是气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs），另一类是化学感受蛋白（Chemosensory Protein，CSPs）[6]。CSPs由100～120个氨基酸残基组成，一般为10～15 kDa的可溶性低分子蛋白质，有4个保守的半胱氨酸，分别由2个二硫键（S-S）连接[7]。到目前为止，已从包括鳞翅目在内的10多个目昆虫中鉴定了大量的 CSPs[8]，其在雄性和雌性昆虫的触角[9]、喙[10]、下唇须[11]等化学感受器官和足[12]、翅膀[13]、性腺[14]、射精管[15]等非嗅觉器官中都有表达。近年研究报道CSPs在昆虫的非感觉器官中被赋予了不同的功能，如信息素传递、营养溶解、发育和抗药性等[16]。小地老虎性腺转录组数据分析显示，AipsCSP2基因的RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）值在雌蛾性腺中相对较高，暗示该蛋白有可能参与生殖相关的生理过程[17]。为深入研究其功能，本文克隆了AipsCSP2基因，运用qPCR探究了其在小地老虎各组织中的表达情况，通过原核表达、荧光竞争性结合试验等对该基因的功能进行了初步探讨，为阐明该虫的化学感受机制及开展行为调控技术的开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试虫及组织收集

小地老虎幼虫用人工饲料饲养，主要成分为小麦胚、酪蛋白和蔗糖。养虫室饲养条件为（24±1）℃，相对湿度（75±5）%，光周期 16L∶8D。化蛹后分雌雄并分别放在塑料杯中至羽化，成虫羽化后饲喂20%的蜂蜜水。取分开饲养的羽化后4日龄雌、雄成虫各100头，取其头（去除触角）、胸、腹（去除性腺或附腺）、足、翅、触角、喙、下唇须、性腺及附腺，立即放于液氮中，然后放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司（美国），cDNA第一链合成试剂盒FastQuant RT Kit（with gDNase）、荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）均为天根生化科技有限公司（北京）产品，TaqPCR MasterMix购自博迈德基因技术有限公司（北京），限制性内切酶购自TaKaRa（大连）公司，DNA 凝胶回收试剂盒购自Axygen公司（杭州），1-NPN及气味标样购自Sigma公司、东京化成工业株式会社等。

1.3 小地老虎CSP2基因同源性分析和进化树构建

小地老虎化学感受蛋白基因序列由本实验室通过小地老虎雌蛾性腺组织转录组测序获得，进一步采用PCR对性腺转录组获得的基因序列进行克隆和验证。利用基因探索者软件将核苷酸序列翻译成蛋白序列；利用在线网站（http://web.expasy.org/compute_pi/）预测AipsCSP2蛋白的分子量和等电点；利用 SignalP 4.1软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测AipsCSP2的信号肽序列；利用DNAMAN软件分析小地老虎CSPs氨基酸序列的同源性；利用MEGA 5.0软件的邻接法（抽样次1000）对小地老虎已报道的CSPs及其他代表性鳞翅目昆虫的CSPs构建系统进化树。

1.4 小地老虎成虫各组织RNA提取和cDNA的合成

小地老虎雌、雄成虫的头（去除触角）、胸、腹（去除性腺或附腺）、足、翅、触角、喙、下唇须、性腺及附腺的RNA使用Trizol提取，方法依照说明书操作。提取的各组织RNA均通过琼脂糖凝胶电泳检测质量，用微量分光光度计NanoPhotometer N60测定浓度和纯度。各组织RNA均取1 μg用cDNA第一链合成试剂盒FastQuant RT Kit（with gDNase）合成 cDNA第一链，稀释至200 ng/μL，作为qPCR分析的模板。

1.5 小地老虎CSP2基因组织表达谱分析

以反转录得到的小地老虎雌、雄成虫各组织第一链cDNA为模板，在Applied Biosystem 7500 System（USA）上进行qPCR反应，进行3次生物学重复和3次技术重复。反应体系 （20 μL） ：SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，模板 cDNA 1 μL，RNase-free ddH2O 7.4 μL。反应程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，40个循环。试验之前对基因和内参的扩增引物进行扩增效率的验证，保证引物扩增效率在95%～105%，所用引物序列见表1。

选取小地老虎的肌动蛋白β-actin基因（登录号GenBank Acc.JQ822245）为内参基因进行相对表达量计算，采用2-△△Ct值法计算目的基因的相对表达量[18]，目标基因在不同的组织之间的差异显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA），然后采用Tukey’s honestly significance difference（HSD）法进行多重比较，用SPSS Statistics 19.0软件进行计算。

1.6 小地老虎CSP2基因表达载体的构建

使用SignalP 4.1软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测小地老虎信号肽。基于预测结果将信号肽相应的核酸序列从 ORF区域去除，根据去信号肽后的基因序列设计特异性表达引物，并在引物两端分别添加酶切位点NdeI和EcoR I（表1）。用TaqPCR MasterMix扩增，体系和程序见说明书。扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测。利用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化后连接到pEASYT3载体上，然后转入大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1内，并送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。对测序正确的重组质粒进行扩大培养并提取质粒。内切酶NdeI和EcoR I对pET-30a (+)载体和pEASY-T3载体进行双酶切，酶切后进行凝胶回收。使用T4 DNA连接酶对回收的基因片段和pET-30a (+)载体进行连接，并将连接产物转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内送公司测序。

表1 本试验所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 小地老虎CSP2的诱导表达与纯化

取50 μL测序正确的菌液于5 mL LB培养基中过夜培养。次日将5 mL过夜培养后的菌液转入500 mL LB培养基中37 ℃，200 r/min培养2～3 h，当菌液的OD600值达到0.6～0.8时加入IPTG，使其终浓度为1 mmol/L，200 r/min、37 ℃继续培养8 h，超声破碎处理菌液后分别取上清和沉淀部分进行SDS-PAGE电泳检测，发现目标蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。参照包涵体复性方法对沉淀蛋白复性，随后采用阳离子交换层析柱HiTrap SP HP columns（GE Healthcare Biosciences，Uppsala，Sweden）对AipsCSP2重组蛋白进行纯化，对纯化后的蛋白进行超滤和浓缩后用分子量7000的透析袋进行脱盐处理，SDS-PAGE检测纯化AipsCSP2蛋白的分子量大小及纯度。最后以牛血清蛋白BSA（bovine serum albumin，BSA）为标准蛋白，对纯化并浓缩好的AipsCSP2蛋白进行浓度测定。

1.8 小地老虎CSP2 荧光竞争结合试验

用F-380型荧光分光光度计（中国天津）进行配体荧光竞争结合试验。将荧光探针1-NPN溶于色谱纯级甲醇至终浓度为1 mmol/L。所用容器为1 cm宽的石英杯，将仪器狭缝宽度设置为10 nm。增益值为3，灵敏度为2，激发波长为337 nm（扫描的发射波长范围），使总体积为1 mL，蛋白终浓度为2 μmol/L。随后向比色皿中加入1-NPN探针，使浓度由2 μmol/L递增直至荧光强度稳定，稳定后分别记录荧光最大值，重复测定3次。利用Scatchard方程计算AipsCSP2/1-NPN的结合常数。

气味分子和AipsCSP2蛋白的结合能力测定步骤如下：在荧光比色皿中加入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），然后加入AipsCSP2蛋白溶液和荧光探针1-NPN，终浓度都为2 μmol/L，待荧光强度稳定后，记录最大荧光强度。将溶于甲醇的气味标样（1 mmol/L）逐次加入到比色皿中，浓度从2～20 μmol/L递增，记录荧光强度变化情况。每次试验重复3次。假设AipsCSP2 蛋白的活性为100%，且在饱和状态下蛋白与气体分子的结合比为1∶1，根据IC50值（AipsCSP2/1-NPN复合物的荧光强度值下降一半时配基气味分子的浓度）来计算气味标样与蛋白的结合常数（Ki）。公式为Ki＝IC50/[1+(1-NPN)/K1-NPN］，其中1-NPN为未结合的1-NPN的浓度，K1-NPN为AipsCSP2/1-NPN的结合常数[19]。

2 结果与分析

2.1小地老虎CSP2序列比对和进化树构建

AipsCSP2基因开放阅读框（Open reading frame，ORF）长度为360 bp，编码119个氨基酸，并且氨基酸序列中具有4个保守半胱氨酸位点（图1），符合C1X6C2X17- 19C3X2C4（C：半胱氨酸，X：随机的氨基酸）结构域，属于典型的化学感受蛋白家族[20]。信号肽预测表明N末端含有16个氨基酸组成的信号肽，去除信号肽后预测成熟蛋白分子量大小为11.7 kD，等电点为7.84。系统进化树显示小地老虎的8个CSP的氨基酸序列在进化树中是分散的，AipsCSP2并没有与其他种类聚为一支（图2），说明其与目前已有研究的其他鳞翅目昆虫CSPs进化关系较远。

图2 基于氨基酸序列构建的小地老虎及其他代表性鳞翅目昆虫CSP的系统进化树（邻接法，1000次重复）Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of A.ipsilon and other lepidopteran CSPs (neighbor-joining method, 1000 replicates)

2.2 小地老虎CSP2组织表达谱分析

利用荧光定量PCR检测了AipsCSP2基因在雌、雄成虫不同组织中的表达水平（图3）。qPCR结果显示，AipsCSP2在雌成虫性腺和雄成虫附腺中特异高表达，并且和其他组织表达量存在显著差异，在雌成虫中，足的表达量最低，性腺中表达量约为足表达量的 2800倍，其他部位表达量较低；在雄成虫中附腺表达量约为足表达量的700倍，其他部位表达量较低。

图3 AipsCSP2在小地老虎雌成虫（A）和雄成虫（B）各组织中表达量的qPCR分析Fig.3 qPCR analyses of AipsCSP2 gene in different adult tissues of female (A) and male (B) A.ipsilon

2.3 小地老虎CSP2结合特性分析

构建pET30a/AipsCSP2表达载体，导入大肠杆菌中进行重组蛋白的大量表达，纯化后得到AipsCSP2蛋白，大小为12 kD左右，与预测分子量一致（图4）。首先测定了AipsCSP2蛋白与荧光探针1-NPN的结合能力，结果表明两者间具有较好的结合能力（Kd＝4.97 μmol/L）且具有饱和效应（图5），说明可以通过荧光竞争性结合试验测定AipsCSP2与不同气味物质的结合能力。测定显示，AipsCSP2蛋白与小地老虎主要的性信息素组分顺 7-十二碳乙酸酯以及次要信息素组分顺-8-十二碳乙酸酯的结合强度为中等，Ki值分别为7.91 μmol/L和8.41 μmol/L；和顺5-十碳乙酸酯结合能力较弱，Ki值为10.51 μmol/L；和顺9-十四碳乙酸酯、顺11-十六碳乙酸酯没有结合能力，Ki值均无法得到。在醇类性信息素中，AipsCSP2与十四烷醇有着极强的结合能力，Ki值为1.10 μmol/L；在醛类性信息素中，和顺-9-十六碳醛、顺-11-十六碳醛和顺-7-十六碳醛有着极其强的结合能力，Ki 值分别为 0.63、1.48、1.51 μmol/L，和十四醛三聚物有着较强的结合能力，Ki值为2.16 μmol/L；在酯类性信息素中，与顺9-十二碳烯-1-醇乙酸酯有较强的结合能力，Ki 值为 3.97 μmol/L；在小地老虎主要寄主植物挥发物中均结合较弱或者不结合（表2）。

图4 AipsCSP2蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the AipsCSP2

表2 不同配基对AipsCSP2蛋白的IC50值和解离常数Ki（μmol/L）Table 2 IC50 and dissociation constants Ki of ligands to AipsCSP2

图5 AipsCSP2与荧光探针1-NPN的结合曲线Fig.5 Binding curse of 1-NPN to AipsCSP2

3 讨论

昆虫化学感受蛋白广泛存在于昆虫体内的化学感受器淋巴液中，是一类小分子量的水溶性蛋白[21]。第一个CSPs家族蛋白是在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中被鉴定出来的，由于该蛋白在触角中特异性表达，因此在被命名为CSP之前，它也被称作OS-D（Olfactory specific protein D）[22]，随后相继在各类昆虫中得到广泛鉴定，如在鳞翅目、直翅目、膜翅目、蜚蠊目、半翅目、竹节虫目等十多个目中发现了很多编码CSP的基因[23]。

CSPs的组织表达部位比较广泛，研究显示其除了大量表达于触角、喙及跗节等化学感受器官中之外，在信息素腺体中也有很高的表达丰度[24]。对家蚕Bombyxmori雌蛾性信息素腺体的蛋白质组学研究表明，至少有7个CSP和1个OBP基因大量表达[25]，BmorCSP6、BmorCSP11、BmorCSP15 仅表达在雌虫信息素腺体中，而且其对信息素有特异的结合能力[14]。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaSexiCSP3在雌虫卵巢中表达量远远高于雄虫精巢，RNAi干扰其表达后，成虫产卵能力显著下降70%左右，而且卵的孵化率也仅有6.2%[26]。

在本研究中，不同昆虫物种的CSPs序列的进化树分析显示AipsCSP2并没有与其他种类聚为一支，说明AipsCSP2与目前已有研究的其他鳞翅目昆虫CSPs 进化关系较远。为研究AipsCSP2的功能，首先在mRNA水平利用qPCR对其在雌、雄成虫不同组织的表达情况进行了研究，结果显示，AipsCSP2在雌成虫性腺和雄成虫附腺中特异高表达，暗示其参与了与生殖有关的活动。荧光竞争结合试验显示，AipsCSP2蛋白和小地老虎性信息素组分顺11-十六碳乙酸酯的合成前体顺-11-十六碳醛有着极其强的结合能力，和小地老虎性信息素组分顺-7-十二碳乙酸酯、顺-8-十二碳乙酸酯的结合能力为中等，表明其可能参与了小地老虎性信息素的合成过程，此外AipsCSP2蛋白和其他鳞翅目昆虫的醇类和醛类性信息素如十四烷醇、顺-9-十六碳醛、顺-7-十六碳醛也有着极其强的结合能力，暗示其可能参与了小地老虎和其他近缘种鳞翅目夜蛾科昆虫性信息素的辨识过程，与小地老虎主要寄主植物挥发物结合能力较弱或不结合，表明其可能没有参与嗅觉识别和寻找寄主的生理过程。接下来，我们将对AipsCSP2进行基因沉默，从电生理和行为学水平验证该蛋白在小地老虎中的生理功能。