甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素化学发光免疫检测方法的建立及分析性能评估

许君艳，庄路阳，王 丹，杨 敏

郑州安图生物工程股份有限公司，河南郑州 450000

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGLs)是罕见的内分泌肿瘤，分别在肾上腺和神经节出现。PPGLs最常见的临床表现是高血压，多数患者表现为难治性高血压，伴随有头痛、心悸、多汗、头晕、恶心、胸闷、腹痛等症状[1-4]。随着研究者和临床专家们对PPGLs发病机制和相关标志物的认识不断深入，以及检测技术的不断发展，检测血浆或尿液中的甲氧基肾上腺素(MN)和甲氧基去甲肾上腺素(NMN)被认为是目前辅助诊断PPGLs的最有效手段[5-7]。

由于我国对MN、NMN的检测以质谱技术为主，缺乏化学发光免疫分析法检测产品，本研究依据国内首次公开的技术与资料[8-9]，建立针对MN和NMN的化学发光免疫检测技术。该技术具有快速、经济、自动化程度高、检测准确等优点，便于临床的推广和使用，更好地辅助PPGLs的临床诊断。

1 材料与方法

1.1材料 MN与NMN纯品购自TRC公司，结构类似物纯品购自阿拉丁；MN的特异性多克隆抗体与NMN的特异性多克隆抗体均购自郑州伊美诺生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)购自上海生工公司。表面包裹有羧基功能基团的磁微粒购自德国Merk公司。生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯购自百灵威科技公司。

1.2试剂的配制 (1)检测试剂稀释液的配制：配制Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH7.4)，加入0.5%(m/v)的牛血清清蛋白，0.1%(m/v)的Proclin 300。(2)磁微粒包被：按照磁珠供应商提供的操作指南将MN抗体或NMN抗体包被于磁微粒表面，抗体/磁微粒的比例为25 μg/mg。包被完成的磁微粒储存于上述检测试剂稀释液中，磁微粒终水平为1 mg/mL；制备完成的两种磁微粒混悬液于2～8 ℃储存备用。(3)SA-HRP溶液的配制：将SA-HRP按照1/5 000(v/v)的比例加入上述检测试剂稀释液中，振荡混匀，2～8 ℃储存备用。(4)校准品的配制：校准品稀释液为0.1 mol/L的盐酸溶液，溶液中加入不同水平的MN和NMN纯品，制备出一组MN水平为0、20、60、200、600、2 000 ng/mL，NMN水平为0、30、90、300、900、3 000 ng/mL的混合校准品，2～8 ℃储存备用。

1.3实验仪器 郑州安图生物工程股份有限公司生产的AutoLumo A2000全自动检测分析仪。

1.4方法

1.4.1标本制备 特异性评估标本的制备：交叉品选择了儿茶酚胺类物质代谢过程中的结构类似物，如L型多巴(L-Dopa)、3-甲氧酪胺(3-MT)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)以及MN、NMN。将MN与NMN的交叉品分别添加到校准品稀释液中，配置成高、低水平的交叉标本。重复性评估标本的制备：校准品稀释液中加入不同水平的MN和NMN纯品，配制出高、中、低3个水平的标本。稀释线性评估标本的制备：将MN、NMN纯品添加到校准品稀释液中，使MN水平为3 000 ng/mL左右、NMN水平为4 000 ng/mL左右，把该标本作为高值，校准品稀释液作为低值，将高值和低值按照一定比例混合，制备出涵盖整个校准区间的系列标本。

1.4.2标本酰化处理 将适量生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于DMSO中，混匀，作为酰化剂备用。取100 μL各个水平的校准品以及其他标本加入等体积Tris-HCl缓冲液(0.5 mol/L,pH8.0)混匀。校准品及标本中加入上述配制的酰化剂，使生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的终水平为0.5 mg/mL，彻底混匀。

1.4.3标本检测 将酰化处理后的校准品及标本转移至反应杯中，使用AutoLumo A2000全自动检测分析仪进行检测。MN或NMN的检测试剂分别检测处理好的系列校准品，并按照四参数法拟合剂量反应曲线(校准曲线)，用于检测标本的结果计算。

1.4.4特异性评估 复孔检测经酰化处理的交叉品，并计算检测结果的均值。按照以下公式计算交叉率：交叉率=添加标本的检测结果/交叉品的添加水平×100%。

1.4.7稀释线性评估 复孔检测经酰化处理的稀释线性标本，计算检测结果的均值，并按照稀释比例计算出每支标本的理论水平；比较、分析理论水平与实测水平的一致性。

1.4.8稳定性评估 将MN检测试剂的组分(MN抗体包被的磁微粒混悬液、SA-HRP溶液和校准品)和NMN检测试剂的组分(NMN抗体包被的磁微粒混悬液、SA-HRP溶液和校准品)放置于37 ℃温箱中，7 d后取出，作为37 ℃组。将配置好的校准品作为标本，分别将37 ℃组和对照组试剂(4 ℃放置的试剂组分)拟合校准曲线后，同步检测校准品，并计算检测水平，分别比较4 ℃组和37 ℃组试剂检测水平之间的偏差。

2 结 果

2.1特异性 交叉品添加水平以及交叉率见表1。结果显示，MN抗体与L-Dopa、3-MT、DA、E、NE和NMN的交叉率小于1%，NMN抗体与L-Dopa、3-MT、DA、E、NE和MN的交叉率小于1%。

表1 两种检测试剂的特异性评估

续表1 两种检测试剂的特异性评估

2.3重复性 观察检测结果，确认无离群值；重复性结果见表2。数据显示，MN检测试剂的CV为4.79%～5.25%，NMN检测试剂的CV为3.85%～4.73%，可以满足临床使用的一般要求。

表2 不同水平标本的CV

2.4稀释线性 将每个标本的实测水平值作为横坐标，理论水平作为纵坐标进行相关性分析。结果显示，建立的MN、NMN检测方法均有较好的稀释线性(图1～2)。

图1 MN稀释线性评估结果

图2 NMN稀释线性评估结果

2.5稳定性评估 稳定性评估的目的是评估试剂长期放置后检测结果的准确性，结果见表3。数据显示，MN两组检测试剂的水平1的偏差略大，NMN两组检测试剂的水平1、水平2的结果偏差略大，但是均<±10%。

表3 检测试剂的稳定性评估

3 讨 论

研究表明，PPGLs的大多数临床后遗症和并发症与高血压有关，可以导致心、脑、肾血管系统的严重并发症，占社区高血压病例的0.1%～0.6%，从而造成巨大的社会经济负担[1-4]。PPGLs的生化诊断指标是检测血浆或24 h尿液中MN和NMN，液相色谱电化学检测法(LC-ECD)是MN和NMN最初的检测技术，后来被串联质谱法(如LC-MS/MS)或免疫测定方法取代[10-11]。LC-MS/MS因其高灵敏度、高特异度等优点逐渐被广泛用于MN、NMN、其他儿茶酚胺类物质及其代谢物的检测,但不同实验室间的检测结果差异大,无可比性[12]。同时，由于免疫学检测技术的局限性，MN和NMN的检测目前尚无统一的标准。

无论何种检测技术，都需要对标本进行萃取或解离以实现检测的准确性；免疫学方法为了提高免疫反应的特异性，往往在萃取步骤后会进行酰化处理。MN和NMN在血液和尿液中均以两种形式存在:游离态和硫酸化MN和NMN。具有临床指导意义的是血浆中游离的MN和NMN或24 h尿液中总MN和NMN[6-7,13]。在临床检测中，为了检测尿液中的总MN和NMN，一般通过高温酸解或硫酸酯酶水解的方法[14]将硫酸化MN和NMN转化为游离MN和NMN。本研究中使用的标本为稀释液中添加游离MN和NMN化学纯品，不涉及硫酸化MN和NMN的解离，因此标本的前处理仅涉及酰化处理。

为了验证本次建立的检测方法的准确性和稳定性，对检测试剂的特异性、分析灵敏度、重复性、稀释线性及稳定性进行了评估。评估特异性使用的交叉品为MN、NMN在体内合成、转化通路的结构类似物质，各交叉品之间仅有1～2个化学基团的区别。表1中的交叉率显示，本研究选用的两种抗体具有较强的特异性，可以实现MN、NMN的特异性检测。本次研究构建的检测试剂盒分析灵敏度为10.21 ng/mL(MN)和6.91 ng/mL(NMN)。根据国内外学者对健康人血浆、24 h尿液中MN、NMN水平的研究结果[5-6,13，15-16]，本研究构建的检测试剂预计可以实现对尿液标本中MN、NMN的检测。MANZ等[11]构建的MN和NMN的免疫检测产品，其检测限为7.5 pg/mL(MN)和15.0 pg/mL(NMN),可以检测出血浆标本中MN、NMN的水平。本次构建的检测试剂还需要进一步提升灵敏度，以实现血浆标本中更低水平的靶物质检测。本次研究评估的是检测试剂的分析内(批内)重复性，反映的是检测系统的随机误差。标本选用了低、中、高3个水平，目的是为了评估在不同水平区间检测试剂的重复性表现。稀释线性验证是为了明确检测试剂在一定量值区间内的检测准确度，结果显示，MN在23.44～3 000.00 ng/mL具有良好的稀释线性，NMN在31.25～4 000.00 ng/mL具有良好的稀释线性，说明本次构建的MN、NMN检测试剂在一定区间可以实现准确检测。稳定性评估结果显示，建立的MN检测方法的偏差为-8.56%～4.53%，建立的NMN检测方法的偏差为-3.65%～9.22%，偏差符合一般体外诊断试剂的要求，说明两个检测试剂的稳定性较好。

综上所述，本研究建立的化学发光免疫法检测试剂对待测物有较高的特异性，可以初步实现MN、NMN的特异性检测，同时检测试剂具有较好的重复性、稀释线性和稳定性。本研究初步完成MN、NMN化学发光免疫法检测试剂的开发，可以通过进一步的研究继续提升该试剂的性能，为MN、NMN免疫学检测技术的发展和临床应用做出技术支持。