生物饲料伴侣在凡纳滨对虾中的应用研究

刘宝同，梁晶晶，李培根，王永庆，秦 朋，梁 奕

（青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛 266111）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称南美白对虾，是中国重要的经济养殖水产动物之一，凭借生长速度快、营养要求低、出肉率高、抗逆性强等优点，成为我国养殖面积最广、养殖产量最高的对虾种类[1]。据统计，2019 年我国水产品总产量为5 079 万t，其中凡纳滨对虾产量高达181.5 万t[2]。然而，随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，水质污染、疾病爆发、养殖成活率低等一系列问题日渐突出。在影响凡纳滨对虾养殖成功率的诸多因素中，饲料是不可忽视的重要因素，而所投喂的饲料中又有部分饲料蛋白通过粪便以氨氮形式排出体外，既污染水质又造成浪费。微生态制剂和酶制剂在有效剂量下持续使用会改善肠道及生长环境，降低不良环境下动物的应激和疾病发生率[3-5]。但实际饲料生产过程中，为了保证水中稳定性和饲料原料熟化程度，一般会高温（≥90℃）熟化30 min 以上，造成益生菌、酶制剂有效成分损失[6-7]。目前市场上菌酶制剂大多都是在养殖现场以拌料的形式直接投喂，不仅工作量大，而且容易出现拌料不均匀等现象，同时黏附到饲料表面的菌酶入水后易散失到水体中，利用效率低下。本研究将鱼粉、豆粕等基础日粮原料与以丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、蛋白酶、木聚糖酶为主的菌酶制剂按比例通过冷制粒工艺单独制粒（本研究称其为生物饲料伴侣），然后与饲料混合均匀投喂，探究其对凡纳滨对虾生长性能、非特异性免疫能力和肠道菌群的影响，为其在生产实践中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本研究中制备生物饲料伴侣所需原料由青岛根源生物技术集团有限公司提供，基础日粮为常规饲料工艺制备。生物饲料伴侣及基础日粮原料组成及营养成分见表1。

表1 生物饲料伴侣及基础日粮原料组成及营养成分（风干基础）

1.2 试验设计 凡纳滨对虾购于山东省莱阳市羊郡，规格为3～5 cm。试验开始前经7 d 驯化，从中选取192尾规格一致、体质健康、初始重为（0.48±0.04）g 的凡纳滨对虾，随机分为4 组，每组4 缸，每缸12 尾，对照组饲喂基础日粮，试验组分别以生物饲料伴侣按5%、10%、20%比例替代基础日粮进行饲喂，试验期30 d。试验期间维持水温26～28 ℃，pH 8.0～8.4，亚硝酸盐≤0.05 mg/L，弧菌含量＜2 000 CFU/mL。采用电磁式空气泵连续充气，中科直流变频循环水泵流量为12 000 L/h，全系统循环8 次/d，每3 d 换水0.1 m3。

1.3 饲养管理 试验在根源生物集团技术支持中心水生态实验室进行，每日8:30、12:30 和16:30 各投喂1 次。按体重比例调整投喂量，保证吃料时间在60～90 min，每天核对对虾数量，观察摄食情况并记录。

1.4 样品采集与指标检测

1.4.1 生长性能 分别在试验开始前和结束后将凡纳滨对虾禁食16 h，逐缸核对数量后捞出，用滤纸轻轻吸干虾体表面水分后进行称重，计算增重率、饲料系数、特定生长率及成活率。计算公式如下：

增重率（%）=100×[（Wt-W0）/W0]

特定生长率（%/d）=100×[（lnWt-lnW0）/t]

饲料系数=F/（Wt-W0）

成活率（%）=T活/T总×100其中，W0为初始平均体重（g），Wt为终末平均体重（g），t 为试验天数（d），F 为采食量（g），T活为成活尾数，T总为总尾数。

1.4.2 血清非特异性免疫酶活性的测定 用l mL 无菌注射器从对虾头胸甲后插入心脏抽取血液，装至2 mL 无菌EP 管中，于4℃冰箱静置过夜。血清中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均采用试剂盒进行分析测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照说明书提示方法进行测定。

1.4.3 凡纳滨对虾肠道样品采集 在放有冰袋的解剖盘上用无菌解剖剪解剖取出对虾肠道全肠，分装至2 mL无菌EP 管中并标记编号，迅速放入液氮中速冻，之后放于-20℃保存，送至青岛百迈克生物技术有限公司进行微生物多样性分析。采用Illumina 高通量测序样本原始数据，用Trimmomatic 软件进行序列质控，使用Flash 软件进行序列拼接、优化及统计。

1.5 统计分析 试验数据以平均值±标准差表示，使用Excel 处理数据，并用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan's 多重比较检验，以P＜0.05 作为差异显著判断水平。

2 结果

2.1 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾生长性能的影响 由表2 可知，5%、10%和20%替代组在不影响凡纳滨对虾存活率的同时可以提高其增重率、特定生长率并降低饵料系数，与对照组相比，10% 替代组增重率提高19.6%、特定生长率提高7.9%（P＜0.05）。

表2 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾生长性能的影响

2.2 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶活性的影响 由表3 可知，5%、10%和20%替代组均可显著提高凡纳滨对虾血清中ACP 和AKP 的活力，且随替代量增加，各试验组酶活力呈升高趋势（P＞0.05）。5%替代组可提高凡纳滨对虾血清中SOD 活力（P＞0.05），当替代量为10% 和20% 时，其SOD 活力显著高于对照组。

表3 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

2.3 肠道菌群结构分析

2.3.1 凡纳滨对虾肠道菌群结构的α多样性分析 Chao1指数数值越大代表肠道样品中物种总数越多，Shannon指数越高代表肠道样品中菌群多样性越高。由表4 可知，3 个试验组肠道样品中物种总数相比对照组均有不同程度升高，肠道菌群多样性均高于对照组，但差异不显著。

表4 不同处理组凡纳滨对虾的肠道菌群多样性指数

2.3.2 凡纳滨对虾肠道细菌群落主坐标分析（PCoA 分析） PCoA 分析是一种降维排序方法，可以对样本进行分类，进一步展示样品间物种多样性差异。图1 结果显示，各试验组对虾肠道菌群结构较对照组有明显的结构差异。

图1 对虾肠道细菌群落PCoA 分析

2.3.3 凡纳滨对虾肠道细菌群落操作分类单元（OTU）聚类的Venn 图 通过分析表明，各组对虾肠道菌群的共有OTUs 为131 种，其中对照组特有的OTUs 为1 种，5%、10%和20%替代组特有的OTUs 分别为0、1、7 种。各组中OTUs 分别为136、139、151、157 种（图2），分别占总体的84.47%、86.33%、93.78%、97.51%，与α多样性分析结果一致。

图2 肠道细菌群落OTU 的Venn 图

2.3.4 凡纳滨对虾肠道菌群结构分析 由表5 和图3 可以发现，凡纳滨对虾肠道优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroides），二者丰富度之和大于88%。以5%～20% 的生物饲料伴侣替代部分基础日粮饲喂凡纳滨对虾，其肠道菌群中变形菌门和厚壁菌门（Firmicutes）的占比降低，其中10%替代组变形菌门占比、5%替代组和20%替代组厚壁菌门占比均显著低于对照组；试验组拟杆菌门和疣微菌门（Verrucomicrobia）占比增加，但组间差异不显著。

图3 不同饲喂组凡纳滨对虾肠道菌群门水平物种组成

表5 不同饲喂组凡纳滨对虾肠道主要菌门相对丰度 %

进一步分析属水平菌群结构发现，以5%～20% 的生物饲料伴侣替代部分基础日粮，凡纳滨对虾肠道菌群中Formosa属占比均显著高于对照组，且弧菌属（Vibrio）占比显著低于对照组。对虾肠道菌群中其他3 个优势菌属——Spongiimonas属、Ruegeria属、Thalassobius属中，除20%替代组Thalassobius属占比显著高于对照组，其他组与对照组相比均无显著性差异（表6，图4）。

图4 不同饲喂组凡纳滨对虾肠道菌群属水平物种组成

表6 不同饲喂组凡纳滨对虾肠道主要菌群变化 %

3 讨 论

3.1 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾生长指标的影响 生物饲料伴侣含有益生菌和酶，能够通过促进食物消化、提高饲料利用率、促进营养物质吸收等多种途径来提高动物的生长性能[8]。本研究结果显示，使用生物饲料伴侣替代部分基础日粮对凡纳滨对虾的生长性能有积极影响，试验组均能在不影响成活率的前提下提高凡纳滨对虾的增重率、特定增长率并降低饵料系数，其中替代量为10% 最为明显，与对照组具有显著性差异。本研究中的生物饲料伴侣是以丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、蛋白酶、木聚糖酶为主的菌酶制剂经冷制粒而成，其中丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌通过改善肠道形态等来提高机体对营养物质的吸收能力进而实现促生长功能；丁酸梭菌能够发酵肠道内的饲料并产生肠道上皮细胞生长所需的能量物质——短链脂肪酸（SCFA），显著提高凡纳滨对虾的绒毛长度、杯状细胞高度、宽度和皱襞高度，增加肠壁厚度，使对虾肠道绒毛和边缘更加清晰、细胞组织排列更加紧密，进而促进凡纳滨对虾肠道健康[9-11]。芽孢杆菌能够与病原菌竞争生存位点来抑制病原菌的生长，并且能够产生蛋白酶、几丁质酶、消化酶进而提高凡纳滨对虾的肠道稳定性和消化系统[12-13]。

3.2 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾非特异性免疫指标的影响 凡纳滨对虾缺乏特异性免疫，因此其免疫系统由一系列体液免疫因子组成[14]。SOD 具有清除生物体内活性氧自由基、保护细胞免受氧化损伤的功能，而ACP和AKP 则是动物体内参与免疫防御的重要水解酶[15-16]。李军亮[17]在低鱼粉饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌能够显著提升凡纳滨对虾体内ACP 酶含量；胡毅[18]在饲料中添加复合益生菌能够显著提升SOD 酶活且其提升能力优于单一添加菌。He[19]发现在饲料中添加蜡样芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌能够显著提高石斑鱼的免疫酶活及生长性能。本试验发现，试验组ACP 与AKP 酶活较对照组显著升高；除5%替代组SOD 活力与对照组无显著性差异外，其他试验组均显著高于对照组，且酶活都随替代量的增加而升高，说明生物饲料伴侣替代部分基础日粮可提高对虾非特异性免疫能力，与上述文献结果相似。

3.3 生物饲料伴侣对凡纳滨对虾肠道菌群的影响 肠道微生物及其菌群结构的变化对凡纳滨对虾生长具有重要影响，与肠道营养吸收、胃肠发育及肠道免疫有着密切联系。本试验中试验组对虾的Shannon 指数的升高及Simpson 指数的降低，说明肠道细菌区系的多样性和稳定性提高，与孙振丽[20]报道的健康对虾较发病对虾肠道菌群多样性高的结果相比，说明本研究中试验组对虾抗病能力增强。生物饲料伴侣中含有的枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对凡纳滨对虾肠道健康起正向调控。据报道，枯草芽孢杆菌能够提升对虾肠道菌群多样性，且对弧菌属等潜在致病菌存在抑制作用[21]；丁酸梭菌能够通过产生丁酸降低肠道内pH、修复肠黏膜、抑制肠道炎症的发生，同时丁酸梭菌作为肠道土著菌能够促进有益菌的增殖，进而提高机体免疫能力[22-23]。本试验结果表明，在肠道菌群方面以生物饲料伴侣替代部分基础日粮，凡纳滨对虾肠道γ 变形菌纲占比相比对照组明显下降，其中10%替代组相比降低14.19%，同时显示出对弧菌属占比有明显的抑制效果，10% 替代组相比降低13.91%；拟杆菌门在试验组肠道微生物占比上升，10%替代组中拟杆菌门占比上升16.12%，同属于拟杆菌门的Formosa属菌株占比上升。

4 结 论

本试验条件下，以生物饲料伴侣替代部分基础日粮可显著提高凡纳滨对虾的生长性能，增强机体的非特异性免疫力，提高凡纳滨对虾肠道细菌群落区系多样性和稳定性，对凡纳滨对虾肠道有害菌群有一定的抑制作用。综合考虑成本和效果，推荐采用10% 生物饲料伴侣替代基础日粮。