不同电荷态泛素蛋白离子的193 nm紫外光解离质谱

周 敏，石莹莹，李树奇，张凯林，3，崔永亮，张 森，张先燚，孔祥蕾，4

（1.安徽师范大学物理与电子信息学院,芜湖 241000；2.南开大学化学学院元素有机化学国家重点实验室,天津 300071；3.天津大学精密仪器与光电子工程学院,天津 300072；4.南开大学化学科学与工程创新中心,天津 300071）

自顶向下（Top-down）的蛋白质组学能够在完整蛋白质的分子水平上提供精准和丰富的生物学信息，在蛋白质翻译后修饰及其关联性等研究中有着独特的优势［1～3］.在此类研究中，需要使用不同的裂解方式，如碰撞辅助解离（CAD）或碰撞诱导解离（CID）［4，5］、高能碰撞解离（HCD）［6］、电子捕获解离（ECD）［7～10］、电子转移解离（ETD）［11，12］及红外多光子解离（IRMPD）［13～17］等，对多种多肽和蛋白分子进行多样化的串联质谱研究和数据分析.如果在实验中采用不同解离方法的组合，如IRMPD+ECD，IRMPD+ETD以及ETD+CID（HCD）等，则能更有效地提高肽链的裂解效率，获得更丰富的结构信息［18～24］.

近年来，紫外光解离（UVPD）技术因其独特和高效的裂解模式，在此类应用中受到广泛关注［25～34］.尽管对有机小分子或短肽UVPD的实验研究在飞行时间质谱和线性离子阱等不同的质谱仪器上已经广泛开展，但对于完整的蛋白质离子来说，其UVPD实验需要借助于具有很高分辨率的质谱仪器.2013年，Shaw等［25］对轨道阱（Orbitrap）质谱仪进行改装，通过加装光学窗口将紫外激光引入到HCD池中，并利用Orbitrap对光解离的碎片离子进行了高分辨的质谱分析.2016年，Shaw等［34］对一台磁场强度为15特斯拉（15 T）的高分辨傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪进行改装，并获得了完整蛋白的193 nm的UVPD质谱，并研究了光致电子对这一解离过程的影响.本文将一台准分子激光器与一台7 T的FT-ICR质谱仪相结合，系统地研究了不同电荷态（+7～+13）的质子化泛素蛋白离子在193 nm紫外激光照射下裂解产生的碎片离子质谱，并将该分析结果与在同一装置上获得的CAD实验结果进行了比较.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛泛素蛋白（Bovine ubiquitin，纯度98%）购自Sigma-Aldrich公司，未经纯化直接使用；Milli-Q型超纯水系统，美国Millipore公司；甲醇（色谱纯）购于百灵威科技；乙酸（色谱纯）购自天津市光复精细化工研究所；进行电喷雾电离源（ESI）实验前，以水为溶剂制备2 mmol/L牛泛素蛋白溶液，并进一步稀释成为1μmol/L水/甲醇/乙酸（体积比49∶49∶2）溶液直接使用.

自行构建紫外-可见-红外光解离质谱/光谱研究平台［35，36］，该平台配有一台电喷雾离子源的IonSpec型傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪（7.0 T，美国Varian公司）和多台激光器；Excimer Lasers Series CL5300型准分子激光器（193 nm）购自俄罗斯OPTOSYSTEMS公司；激光照射时间利用一台程序控制的SSH-R型机械快门（日本Sigma-Koki株式会社）来实现.

1.2 实验方法

实验中质谱采用正离子模式，质荷比（m/z）扫描范围为400～2000.ESI离子源预热温度设定为80℃，探针电压根据不同价态的目标离子分别进行优化后设定：+7～+10和+11～+13价离子分别设定为3.6和3.1 kV.

使用注射泵将制备的牛泛素蛋白样品溶液以120μL/h的速度注入电喷雾离子源中，产生不同价态的目标蛋白离子.通过存储波逆傅里叶变换的方法［37］，依次在傅里叶变换离子回旋共振仪的分析池中选出不同电荷态的泛素蛋白离子并进行光解离质谱研究.

光解离实验中，将193 nm的紫外激光引入到分析池中照射母体离子，并记录解离后的质谱图.光路系统经过严格的准直调节，避免由于光束照射到分析池表面而影响电子对解离过程.照射时间为8 s，激光器的典型输出能量为0.5 mJ/pulse，频率为10 Hz.

在激光照射过程中，为更加有效地收集碎片离子，利用脉冲阀将氮气分2次引入质谱仪的分析池中，使得分析池的真空约维持在8.0×10-6Pa.激光照射结束后，等待5 s，当系统真空恢复到约1.0×10-7Pa时，开始采集质谱数据.在对比的CAD实验中，离子的产生和选择过程相同，但离子的裂解则通过持续非共振辐射（SORI）［38］的方式来实现.

1.3 数据分析

质谱数据分析利用实验室自编的数据分析软件（NKTD）进行［39］.通过“一对多”的方法寻找目标碎片离子，并将实验峰与理论峰进行匹配和打分，用于发现和确认不同价态和类型的碎片离子.所有主要离子类型（a，a+1，b-1，b，b+1，c-1，c，c+1，x-1，x+1，x+1，y，y-1，z-1，z和z+1）以及H2O和NH3损失可能产生的碎片离子均被考虑［25］.质谱峰的误差容忍和最低信噪比（S/N）被分别设置为0.002%和S/N＞3，每张质谱图通过累加3次得到.

2 结果与讨论

2.1 光解离质谱

将193 nm激光引入FT-ICR质谱仪的分析池，并对激光能量和照射时间进行优化，从而获得紫外光解离后产生的碎片离子的质谱.但对于泛素离子，所观察到的碎片离子的丰度和种类仍非常有限.进一步实验发现，在激光照射过程中向分析池中引入适当的碰撞气体氮气，可以明显改善碎片离子的丰度和种类.但过多地引入气体，会在一定程度上破坏分析池中的真空，反而会降低观察到的离子种类，并使仪器的分辨率和测量的质量准确度明显变差.综合优化上述条件后，获得了不同电荷态（+7～+13）的泛素蛋白离子在吸收193 nm紫外光子后产生的光解离碎片离子质谱（图1）.可见，+7和+8价的泛素蛋白离子裂解产生的碎片离子相对较少，且大多分布在母体离子峰附近；而+10和+11价的离子裂解产生的碎片离子相对较多，且质荷比（m/z）的分布相对较广.

Fig.1 193 nm UVPD mass spectra of ubiquitin ions with different charge statesThe corresponding charge states of（A）—（G）were+7—+13.

2.2 数据分析及讨论

为了对以上数据进一步深入理解，利用本课题组自行开发的NKTD软件对获得的不同电荷态（+7～+13）离子的光解离质谱图进行分析，即对其中的碎片离子进行指认、归属和分析（图2）.为了便于比较，也对+7～+13价的泛素离子进行了CAD实验及相应的数据分析，结果见图2.另外，为了更好地说明离子种类的分布情况，CAD和UVPD实验结果中不同种类碎片离子的占比分布信息分别列于图3和图4.CAD实验产生的离子种类为b离子和y离子，与文献［4］报道一致.对于大部分不同价态的离子，其主要碎片为y离子；对于+9～+11价的离子，其b离子占总碎片离子的比例为40%～50%（图3）.对于UVPD实验结果，其碎片离子组成基本包含全部种类的碎片离子.其中，最重要的碎片离子为y离子和a离子.尽管b离子和z离子在所有价态离子的实验结果中都能被观察到，但在不同价态离子中所占的比例有所不同（图4）.这表明193 nm UVPD过程中同时存在分子内振动再分配前与再分配后发生的裂解模式，与文献［25］报道一致.但从细节来看，这些结果与在Orbitrap质谱仪进行UVPD实验所得结果也有区别.Brodbelt等［25］发现，a，x，y和z离子拥有较强的信号，但b离子的信号较弱.本实验中获得信号相对较强的b离子，这与向分析池中引入的碰撞气体所引发的进一步碰撞辅助解离有关.

Fig.2 Fragment ion analysis of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13),obtained by the methods of CAD(A—G)and 193 nm UVPD(A′—G′),respectivelyThe corresponding charge states of（A）—（G）were+7—+13.The charge states of the corresponding ions were identified in each subgraph.The abscissa of each subgraph corresponded to the amino acid sequence of ubiquitin，and the ordinate corresponded to the intensity of fragment ion，and the types of fragment ions were represented by their colors.

Fig.3 The types and distribution of CAD fragment ions of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13,A—G)The values indicated the ratios of corresponding ions in different types.

Fig.4 The types and distribution of UVPD fragment ions of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13,A—G)The values indicated the ratios of corresponding ions in different types.

图2 和图5分别给出不同裂解方式获得的不同价态蛋白离子序列的断裂位点及其覆盖率.其中UVPD实验与CAD实验结果明显不同：对于不同价态的离子，其裂解的位点和覆盖率也有较大区别.对于+7价离子，其序列覆盖率明显优于CAD实验结果；对于+8和+9价离子，其覆盖率（约20%）与CAD实验结果相当，但2种方法中发生断裂的位点则明显不同，具有较好的互补性.对于+10～+12价离子，UVPD实验中离子断裂位点的覆盖率显著高于CAD实验结果.其中，对于+11价离子，其UVPD碎片覆盖率接近80%，远优于CAD实验结果中的20%.这一结果虽然低于Shaw等［25］在Orbitrap上获得的实验结果（接近100%），但与Shaw等［34］在15 T的FT-ICR质谱仪上获得的92%的碎片覆盖率已经比较接近.对于+13价离子，UVPD实验结果虽然与CAD相比有很大提高，但仍低于20%.注意到UVPD方法与CAD方法在断裂方式和位点上的互补，将2种实验分析结果进行组合，可以方便地实现蛋白质离子碎片覆盖率的提高（图5中CAD+UV图例）.

Fig.5 Sequence coverage observed during the cleavage of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13)by different methods

虽然本文实验中获得的+11价离子的覆盖率已经接近Shaw等［25，34］在Orbitrap及FT-ICR质谱仪上所获得的结果，但仍有一定的区别.本文实验中UVPD碎片覆盖率明显与离子价态相关，但Shaw等［25］在Orbitrap上的实验结果则并未体现出这种相关性，即不同价态的离子在HCD池中发生UVPD后产生的覆盖率基本相当.本文实验中的低价态离子的覆盖率明显低于+10～+12价离子，这一现象更接近于早先在FT-ICR质谱仪上进行的ECD实验结果［7，8］，显示出蛋白离子的解离程度可能与其空间折叠程度有着某种关联.另外，本文实验中观察到大部分离子的整体蛋白序列覆盖率和碎片离子种类与丰度仍比较低.其原因是多面的：（1）UVPD实验中产生的具有较高初始平动能的离子难以被有效囚禁和被探测到，仍需要进一步改进或优化实验条件；（2）受到本次实验中仪器本身条件的一些限制，如由于实验中使用的FT-ICR质谱仪的控制系统较为老旧，内存有限，对比之前实验中的单张质谱图一般都采用了50次或以上的积累［25，34］，目前系统无法完成3次以上的数据积累；与Shaw等［34］在FT-ICR上的实验相比，本文实验中采用的磁场强度为7 T也明显低于Shaw等的实验（15 T）；（3）目标离子选择目前都是在FT-ICR分析池中完成的，经过离子选择后，在进行UVPD实验前，+7和+13价离子的强度大约只有+11价离子强度的1/5，无法完成目标离子在UVPD前的预积累，这也可能是本实验中+7和+13价离子覆盖率低的一个重要原因.

基于上述分析和讨论，为更好地发挥UVPD技术与FT-ICR质谱在蛋白结构分析中的作用，仍需要从实验方法和仪器方面加以改进.除了计划通过更新仪器控制系统以实现数据的多次累加和引入线性离子阱以实现目标离子的选择和预富集之外，还计划在离子活化和碎片离子的冷却和有效囚禁方面进行改善，如通过组合不同裂解方法来改善其碎片离子种类和蛋白序列覆盖率，以便扩展到更大尺寸的蛋白离子的研究中.

3 结 论

通过将193 nm激光引入FT-ICR质谱仪分析池，获得了蛋白质离子紫外光解离（UVPD）质谱图.利用这一方法，对不同价态的泛素蛋白离子的紫外光解离质谱进行了系统研究.结果表明，通过在激光照射过程中向分析池内引入碰撞气体，不仅能增加母体离子的裂解率，还能提高碎片离子的捕获效率，观察到较为丰富的不同种类的碎片离子.实验中获得了+7～+13价泛素离子的光解离质谱，并将其与碰撞辅助解离（CAD）方法产生的碎片谱进行了分析比较.结果表明，相对于CAD中产生的单纯的b离子和y离子，UVPD方法能够产生更为丰富的碎片离子，这些离子一般以a离子和y离子为主.其中，对于+11价离子，蛋白质序列的覆盖率接近80%，但对于+7～+9价及+13价离子，覆盖率仍较低.通过将UVPD和CAD方法获得的数据进行组合，则可以改善其序列覆盖率，显示了这两种方法的互补性.但如何进一步提高蛋白质离子解离效率和其序列覆盖率，以便其能够在自顶向下蛋白质质谱学中发挥更好的作用，仍需要在离子活化和囚禁，以及数据采集和分析等方面进行更加深入的研究.