一锅法合成去甲基麻黄素

罗 磊，穆晓清，吴 涛，聂 尧，徐 岩

（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122；2.宿迁市江南大学产业技术研究院,宿迁 223800）

去甲基麻黄素（NE）是一种多功能的手性胺化合物，不仅可作为药物活性分子［1］用于合成新型硫脲类和噻唑烷类抗癌药物［2］，还可作为有机合成中的配体和手性助剂［3］，如合成抗艾滋病药物依非韦伦的关键手性助剂（1R，2S）-N-吡咯烷基去甲麻黄素［4］.研究发现，NE在5000种不同的反应中被用作反应物［5］.NE的合成路线具有挑战性，目前报道的生产方法主要包括提取法、化学法、化学酶法和生物法.提取法直接从麻黄原料中提取NE，但其绝对含量低［6］，工业应用受到限制.化学法反应步骤冗长，环境污染严重［7］.化学酶法首先利用丙酮酸脱羧酶（PDC）［8，9］、乙醛羟酸合成酶（ASAHI）［10～12］或麻黄碱脱氢酶（EDH）［13］生物催化合成中间体L-苯基乙酰基甲醇（R-PAC），再经过化学反应制备NE［14］.ASAHI因其活力高、转化率和选择性高且副产物少被广泛应用.虽然，上述方法可大规模生产获得NE［15］，但产物为外消旋体，需进一步拆分，分离过程复杂、耗时长、效率低，并产生大量有机废物.生物法具有环境友好和选择性高等特点，已经成为合成NE的研究热点.目前，生物法制备NE主要以苯基乙酰基甲醇（PAC）和有机胺为底物，通过转氨酶选择性合成光学纯NE，但PAC价格昂贵.2013年，Pohl等［16］以苯甲醛、丙酮酸和丙氨酸为廉价底物经二步法合成了NE，但采用一锅法反应策略时，转氨酶会催化苯甲醛产生副产物苯甲胺，从而降低了产率.2014年，Pohl等［17］又通过级联转氨酶和醇脱氢酶，以1-苯基-1，2-丙二酮为底物，经二步法合成NE，但反应效率较低；同时，为了克服转氨酶存在的反应平衡问题，需添加过量的辅助底物有机胺供体，增加了产物分离难度.目前，生物法合成NE普遍存在底物载量较低和反应效率低等问题.因此，构建高效的PAC制备NE的生物合成途径尤为重要.

目前，可用于PAC制备NE的酶主要包括转氨酶［18，19］、亚胺还原酶［20～23］和胺脱氢酶等［24］.转氨酶催化反应需要有机胺供体，增加了产物的分离难度，且存在反应平衡问题；亚胺还原酶催化反应活力较低，限制了其应用；而胺脱氢酶则以廉价的无机氨为氨基供体，副产物仅为水，原子效率高，因此被认为是更加绿色的高效合成途径.由于天然胺脱氢酶来源少，底物谱狭窄，限制了其工业应用.近年来，随着定向进化技术的发展［25，26］，越来越多的工程化胺脱氢酶被发掘.2012年，Bommarius等［27，28］定向进化了来源于Bacillusstereothermophilus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillusbadius的苯丙氨酸脱氢酶，获得的胺脱氢酶（BsAmDH和BbAmDH）可用于催化手性胺的合成.2020年，Zheng等［29］首次报道了源于Geobacillus kaustophilus的胺脱氢酶（GkAmDH）可催化外消旋底物PAC的还原反应，并进一步对78位和276位进行饱和突变，提高了对外消旋底物PAC的催化活力.

本文通过级联ASAHI催化缩合反应和BbAmDH催化还原胺化反应，以廉价底物苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl为原料，构建了合成NE的新途径（Scheme 1），并通过反应过程控制策略，有效解除了ASAHI的底/产物抑制，提高了底物苯甲醛的载量和转化效率.

Scheme 1 Cascade reaction of synthetizing norephedrine catalyzed by the ASAHI and Bb AmDH

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

重组表达菌株E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH由本实验室构建并保存；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和咪唑购自上海生工生物工程技术有限公司；卡那霉素和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）购于上海索莱宝生物科技有限公司；引物合成和质粒测序由无锡天霖生物科技有限公司完成；质粒提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于美国Omega公司；DNA Marker，蛋白Marker，限制性内切酶XhoⅠ，BamHⅠ，EcoRⅠ和高保真DNA聚合酶（PrimeSTAR Max DNA Polymerase）购于大连Takara公司；同源重组试剂盒（ClonExpress®ⅡOne Step Cloning Kit）购于南京诺唯赞生物科技有限公司；L-苯基乙酰基甲醇（R-PAC）购于江苏艾康公司.AKTA PURIFIER 100型全自动蛋白层析系统，美国General Electric Company公司；FC型酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；C1000 Touch型基因扩增（PCR）仪，美国Bio-Rad公司；VCX750型超声破碎仪，美国Sonic公司；Waters ACQUITY UPLC-MS/MS型液相色谱质谱（LC-MS）联用仪，沃特世科技（上海）有限公司.

1.2 实验过程

1.2.1 重组菌株的诱导与表达 将重组菌E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 r/min条件下振荡培养6～8 h后，转接到700 mL相同培养基中，培养至OD600为0.6～0.8；向培养基中加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，于20℃诱导培养过夜后，收集菌体，于-20℃冷藏保存，用于催化反应.

1.2.2 蛋白纯化 将细胞重悬于缓冲液A（100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+20 mmol/L咪唑，pH=7.5）中，超声破碎，于4℃，12000 r/min条件下离心30 min；上层清液用0.22μm水系滤膜过滤后，上样至Ni-NTA亲和层析预装柱中，然后用缓冲液A洗涤，再用缓冲液B（100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+500 mmol/L咪唑，pH=7.5）进行梯度洗脱，收集目的蛋白；将目的蛋白用超滤管脱盐浓缩，并添加终体积分数为20%的甘油，于-80℃保存，备用.

1.2.3 酶活力的测定E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI酶活测定体系包括100 mmol/L磷酸缓冲溶液，40 mmol/L苯甲醛，80 mmol/L丙酮酸，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，10%（体积分数）DMSO和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI，液相测定苯甲醛消耗.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI酶活力单位（U）定义为每分钟催化反应1μmol苯甲醛的酶活力.酶比活力（U/g）定义为每克E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI细胞所含的酶活力单位数.

BbAmDH酶活力测定体系总体积为200μL，包括NH4Cl/NH4OH（pH=9.5，0.7 mol/L），R-PAC（10 mmol/L），NADH（0.2 mmol/L）及适量纯酶液，检测340 nm处吸光值的变化.酶活力单位（U）定义为每分钟催化氧化1μmol NADH的酶活力.酶比活力（U/g）定义为每克酶蛋白所含的酶活力单位数.

1.2.4 分析方法 苯甲醛和PAC的HPLC分析：Diomansil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），进样量10μL，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温40℃.0～6 min，10%～13%乙腈（体积分数）；6～15 min，13%～30%乙腈；15～30 min，30%乙腈；31～35 min，10%乙腈；PAC在17.3 min出峰，苯甲醛在23 min出峰.R-PAC手性分析：气相色谱（GC-FID），Agilent J＆W CP-Chiralsil-DEX CB色谱柱（25 m×0.32 mm×0.25 μm），升温程序：起始温度100℃，以5℃/min速率升温至200℃；NE采用LC-MS检测［30］.

2 结果与讨论

2.1 ASAHI和Bb AmDH的表达与活力测定

以R-PAC为底物对本实验室菌库进行筛选，获得了具有催化R-PAC活力的胺脱氨酶BbAmDH.对ASAHI和BbAmDH重组菌株进行SDS-PAGE分析发现，ASAHI和BbAmDH在目的分子量60000和40000附近分别有明显条带（图1），表明ASAHI和BbAmDH均能可溶性表达.酶活力测定结果表明，E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI对苯甲醛的活力为11.7 U/mg；BbAmDH对R-PAC的活力为3.2 U/mg.进一步在BbAmDH中引入突变K78S/N276C［29］，突变株对R-PAC的活力提高至4.3 U/mg，是原始株的1.34倍.

2.2 NE前体物质R-PAC的生物合成

2.2.1E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化合成R-PAC的条件优化 通过考察反应温度对E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化缩合反应效率的影响发现，合成R-PAC的最适反应温度在30～40℃间，当温度超过45℃时，R-PAC产率下降，50℃时R-PAC产率不足50%［图2（A）］.通过考察反应pH值对缩合反应效率的影响发现，最适反应pH值为7，酸性条件不利于催化；在碱性条件下，随着pH值的升高，催化效率下降，当pH=11时，细胞丧失催化活力［图2（B）］.已有研究表明，高浓度的苯甲醛和R-PAC会抑制ASAHI催化缩合反应的效率［31］.通过考察不同浓度苯甲醛对缩合反应效率的影响发现，当苯甲醛浓度低于40 mmol/L，其转化率为99%，R-PAC产率为93%，此时苯甲醛对反应无抑制；当苯甲醛浓度超过40 mmol/L，其转化率逐渐下降，表明苯甲醛浓度超过40 mmol/L会对E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI产生底物抑制［图2（C）］.通过考察R-PAC浓度对缩合反应效率的影响发现，在初始反应体系中添加不同浓度R-PAC均会对该反应产生抑制作用，随着添加的R-PAC浓度的增加，抑制作用加强，当添加的R-PAC浓度达到60 mmol/L时，R-PAC产率仅为5%［图2（D）］，表明E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI对R-PAC反馈抑制较敏感.

Fig.1 SDS-PAGE analysisM：protein marker；lanes 1 and 2：crude enzyme/cell-free extracts for ASAHI；lanes 3 and 4：crude enzyme/cell-free extracts for Bb AmDH；lanes 5 and 6：purified Bb AmDH/Bb AmDHK78S/N276C.

Fig.2 Optimization of the enzymatic production of R-PAC（A）pH=7.0；（B）30℃；（C）pH=7.0，30℃；（D）pH=7.0，30℃.Reaction conditions：100 mmol/L PBS buffer，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I.

2.2.2E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化合成R-PAC 为了避免E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI产生底物抑制，研究了底物苯甲醛浓度为40 mmol/L时E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化缩合反应制备R-PAC的反应过程，发现初始阶段反应速率较快，反应1 h时苯甲醛转化效率达到94.3%，R-PAC产率达到87.5%；反应2 h时，苯甲醛转化率为99%，R-PAC产率为93%.此外，在反应过程中，R-PAC的对映体过量（e.e.，%）值维持在99%（图3）.

Fig.3 Carboligation of BA with pyruvate by E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ASAH IReaction conditions：100 mmol/L PBS buffer（pH=7），5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，30℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I.

2.3 NE的生物转化

2.3.1BbAmDH催化R-PAC还原胺化反应合成NE的条件优化 通过考察反应温度和pH值对E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化R-PAC还原胺化反应的影响发现，随着反应温度的升高；R-PAC转化率逐渐升高，当温度达到40℃时，R-PAC转化率达到最大值99%；继续升高温度，R-PAC转化率反而下降［图4（A）］.因此，最适反应温度为40℃.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化还原胺化反应最适的反应pH值为9.5，当反应pH值在8.5～10范围内时，PAC的转化率高于80%，pH值为7时，转化率仅约为20%［图4（B）］，pH值过高或过低都会影响酶的分子构象［32］，从而导致其转化率下降.

Fig.4 Optimization of the enzymatic production of norephedrine（A）pH=9.5；（B）40℃.Reaction conditions：37 mmol/L R-PAC，0.7 mol/L NH4Cl，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.3.2 分步法合成NE反应进程E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化反应的最适pH值分别为7和9.5，由于两者反应最适pH值相差较大，故采用分步法进行反应.首先，通过E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI在pH=7条件下合成中间体R-PAC，再通过E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C在pH=9.5条件下合成NE.通过对分步法合成NE的研究发现，反应2 h时缩合反应（Step 1）结束，40 mmol/L苯甲醛完全转化，生成37 mmol/LR-PAC；在缩合反应结束后，向反应液中补加NH4Cl和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C细胞，调节pH=9.5，进行催化反应；还原胺化反应（Step 2）的前2 h反应较快，R-PAC转化率达到62%，随着底物浓度的下降，反应速率逐渐降低，反应10 h时R-PAC转化率达到99%（图5）.由于第一步反应受到底物抑制，分步法底物载量被限制在40 mmol/L.

Fig.5 Enzymatic production of norephedrine in the two stepsReaction conditions of step 1：100 mmol/L PBS buffer（pH=7），5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，30℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I；step 2：NH4Cl/NH3H2O buffer（0.7 mol/L，pH=9.5）37 mmol/L R-PAC，40℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.4 一锅法合成NE

2.4.1 一锅法反应条件的优化 由于ASAHI存在底/产物抑制，导致分步法底物载量受到限制.将缩合反应和还原胺化反应同时进行（一锅法）能够避免中间产物R-PAC的积累，从而解除抑制，提高批次反应底物浓度和反应效率.首先测定了BbAmDHK78S/N276C对苯甲醛和丙酮酸的活力，发现BbAmDHK78S/N276C对这2个底物均无活力，因此，能有效避免一锅法中副产物苯甲胺的形成.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化反应的最适温度分别为30～40℃和40℃，所以选取40℃进行反应.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C的最适反应pH值分别为7和9.5，pH值会影响两步反应效率.通过研究pH值对一锅法反应效率的影响发现，随着pH值的升高，NE的产率升高，当pH=8.5时，产率最高，继续升高pH值，产率反而下降，表明一锅法最适合反应pH值为8.5［图6（A）］.NH4Cl作为BbAmDHK78S/N276C的辅底物，NH4Cl浓度会影响其反应效率，通过考察NH4Cl浓度对E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C反应效率的影响发现，随着NH4Cl浓度的增加，NE产率升高，当NH4Cl浓度为0.7 mol/L时，NE产率达到最高.随着NH4Cl浓度的进一步升高，NE产率下降［图6（B）］，因此NH4Cl最适反应浓度为0.7 mol/L.

Fig.6 Optimization of the enzymatic production of norephedrine in one-pot（A）40℃，0.7 mol/L NH4Cl；（B）40℃，pH=8.5.Reaction conditions：5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I and 60mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.4.2 一锅法制备NE 在0.7 mol/L NH4Cl，40℃，pH=8.5的最适反应条件下，监测了一锅法合成NE的反应过程.由图7可见，反应前2 h，苯甲醛转化率达到65%，R-PAC缓慢积累，随着底物苯甲醛被消耗，反应速率降低，积累的R-PAC也被缓慢消耗；反应12 h时，苯甲醛转化率为83%.与分步法相比，一锅法由于pH值始终维持在8.5，导致苯甲醛转化速率下降；但中间产物R-PAC一直低于6 mmol/L.

2.4.3 补料策略在一锅法中的应用 实验中发现，一锅法反应过程中R-PAC浓度保持在较低水平（图7），这为流加底物苯甲醛解除底物抑制提供了可行性.通过研究一锅法反应过程发现，反应4 h内苯甲醛的反应速率较快，其转化率达到80%.因此，选择每隔4 h补加苯甲醛至约40 mmol/L.实验中发现，反应4 h苯甲醛转化率达到80%，R-PAC浓度维持在5 mmol/L，此时进行第一次补料，随后苯甲醛被快速转化，R-PAC浓度仍然维持在5 mmol/L，反应8 h进行第二次补料，反应12 h，中止反应，最终苯甲醛浓度为10 mmol/L，R-PAC浓度为4 mmol/L（图8）.一锅法反应通过补料策略，在反应12 h内补料，底物浓度从40 mmol/L提高到100 mmol/L，苯甲醛转化率从83%提高到90%，时空转化率提高2.7倍，反应过程中R-PAC始终维持在约5 mmol/L，解除了底产物抑制，实现了NE的高效合成.

Fig.7 Enzymatic production of norephedrine in one-potReaction conditions：40 mmol/L benzaldehyde+80 mmol/L pyruvate+0.7 mol/L NH4Cl+5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+10%DMSO（volume fraction）+60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I，40℃，pH=8.5 and 60mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

Fig.8 The one-pot enzymatic production of norephedrine in fed-batchReaction conditions：5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+80 mmol/L pyruvate+10% DMSO+40 mmol/L benzaldehyde+0.7 mol/L NH4Cl，40℃，pH=8.5，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.Feeding strategy：feeding of 30 mmol/L benzaldehyde and 30 mmol/L pyruvate every 4 h.

3 结 论

以L-苯基乙酰基甲醇（R-PAC）为底物对本实验室菌库进行筛选，获得具有R-PAC活力的胺脱氢酶（BbAmDH），通过引入突变K78S/N276C，使其对R-PAC的活力提高到4.2 U/mg.通过级联ASAHI和BbAmDH，构建了NE的生物合成新途径.优化分步法反应条件，确定了E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI的最适反应条件为pH=7，30℃，且底物苯甲醛浓度超过40 mmol/L时开始出现底物抑制；同时产物R-PAC也会对ASAHI产生产物抑制.利用分步法在最适反应条件下制备NE，40 mmol/L底物苯甲醛和中间产物R-PAC转化率均达到99%以上.通过对一锅法反应条件进行优化，并采用底物补料策略，有效解除了ASAHI的底/产物抑制作用，底物浓度从40 mmol/L提高到100 mmol/L，苯甲醛转化率达到90%，苯甲醛时空转化率提高2.7倍，实现了NE的绿色高效合成，为其产业化应用奠定了基础.