一种甲基膦酸酯降解菌的筛选、鉴定以及特性分析

李俊红，刘厚权，喻婵

(省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室， 湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉430062)

0 引言

随着现代科技的发展，有机磷产品的使用量日趋增大，水体富营养化以及土壤有机磷农药残留情况日益严重.尤其是土壤中有机磷农药残留，有机磷农药可因食入、吸入或经皮肤吸收而中毒[1].因此，了解有机磷在环境中的降解转化有重要意义.有机磷是自然生态系统中磷循环的主要组成部分，其结构复杂，种类繁多，绝大多数不能被生物体直接吸收利用，只有经过生物或化学反应转化为以可溶性无机磷为主的有效磷才能被生物利用[2-4].在较长一段时间内，人们对磷的地球化学循环研究主要集中在无机磷的生态利用及环境行为上，近些年有机磷的研究才逐步受到重视.目前，在对有机磷的环境行为研究中，研究者们普遍关注于环境介质中复杂有机磷组分的鉴别和相互转化、生物可利用磷的吸收和释放，或者关注于具体的有机磷类污染物在环境介质中的迁移转化行为以及环境要素和微生物对它们的作用影响等，均取得了大量研究成果[5-6].而利用微生物来降解污染物也逐渐引起人们的关注[7]，如假单胞菌属[8]和副单胞菌属[9]是成功用于污染环境中降解有机磷农药的主要微生物.

有机磷转化为可溶性无机磷的地球化学行为是磷循环中的重要一环，也是有机磷研究中的重要组成部分.在微生物作用下，有机磷可被降解成用于合成细胞物质的无机磷酸盐以及其他产物，同时环境中的无机磷可以直接被微生物利用，参与新陈代谢合成含磷物质，随其生命活动释放到水体中，参与自然环境中的磷循环[4,10].因此，在有机磷的研究中，微生物降解的相关研究占有重要的地位.1973年，第一个能够降解有机磷化合物的微生物被分离出来，并被鉴定为黄杆菌属(Flavobacterium)[11].自此，开启了有机磷微生物降解机制研究的大门.但是由于有机磷组分的复杂性，对有机磷迁移转化分子机制的研究多集中于典型有机磷污染物[12-13]，不具有普遍性，选择一种具有有机磷普遍结构的简单物质作为有机磷迁移转化分子机制研究的对象十分必要.甲基膦酸酯是一种结构最简单的磷酸酯，既是其他复杂有机磷分子生物合成的前体，也是多种有机磷分解的代谢产物，常作为代表性物质用于研究有机磷基础地球化学过程[14].

甲基膦酸酯可以作为菌株生长的唯一磷源[15-16]，本研究使用以甲基膦酸酯为唯一磷源的无机盐培养基从海南施用有机磷农药的圣女果培植基地土壤中筛选可以降解甲基膦酸酯的菌株，并进行菌种鉴定.一共筛选到18株可以降解甲基膦酸酯的菌株，对其中生长较好的3株菌测定相同条件下生长曲线和培养基中无机磷的浓度曲线，选出降解效果最好的菌株进行其生长及降解特性的研究.主要研究条件为温度和pH对菌株生长和甲基膦酸酯降解的影响，设置18 ℃、28 ℃和37 ℃ 3种温度探究其在pH为7的条件下以及pH为5、7、9和温度为28 ℃条件下的生长情况以及甲基膦酸酯降解特性.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 甲基膦酸酯(Methylphosphonic acid)购于美国Sigma-Aldrich.Tryptone、Yeast extract购于OXOID.葡萄糖、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4、CoCl2，均为国药公司提供.

1.1.2 培养基 LB培养基：tryptone 10.0 g，yeast extract 5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL.121 ℃，30 min高压蒸汽灭菌.

含5 mmol/L甲基磷酸酯的无机盐培养基：NaCl 0.207 8 g，KCl 0.273 0 g，(NH4)2SO43.000 0 g，MgSO4·7H2O 0.534 0 g，甲基膦酸酯 0.480 1 g，葡萄糖 10.000 0 g.加600 mL蒸馏水后使用NaOH调pH至7，蒸馏水定容至1 000 mL.用之前加0.1%(体积分数)的微量元素溶液，固体培养基为液体培养基额外添加15 g/L的琼脂.108 ℃，20 min高压蒸汽灭菌.

微量元素溶液：MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.20 g，0.22 μm滤膜过滤除菌，避光4 ℃保存.

1.1.3 16S rRNA鉴定引物 使用16S rRNA通用引物，其序列为：

27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[17].

1.2 方法

1.2.1 土样采集 土壤样品采集于施用有机磷农药的圣女果培植基地，位于海南省陵水县光坡镇米桶村.

1.2.2 样品富集 将采集的土壤样品分别置入无菌三角瓶中，加入适量无菌水，于28 ℃、250 r/min摇床振荡打散均匀后，静置30 min.取5 mL静置后的上清液加入盛有50 mL LB培养基的三角瓶中，在28 ℃、250 r/min摇床振荡3～5 d，然后取其中的5 mL接入新的50 mL灭菌LB培养基中培养3 d.

1.2.3 有机磷降解菌的筛选及培养 取富集后的培养液用无菌水分别稀释10-4、10-5、10-6倍，取100 μL稀释后的菌液在含有5 mmol/L甲基磷酸酯的无机盐固体平板上涂匀，28 ℃培养.待长出菌落后挑取单菌落，在新的含有5 mmol/L甲基磷酸酯的无机盐固体平板上划线分离，直到得到形态均一的单菌落.将长出的单菌落分别接种到pH 7，含有5 mmol/L甲基磷酸酯的液体无机盐培养基中，于28 ℃、250 r/min摇床振荡培养.根据菌生长情况来筛选生长较好的菌株.

1.2.4 菌株鉴定 挑取含有5 mmol/L甲基磷酸酯的无机盐固体平板上的单菌落，溶于10 μL无菌水中，使用该菌液作为模板，16S rRNA通用引物27F和1492R扩增该细菌的16S rRNA序列.PCR体系为50 μL体系，菌液2 μL，引物各1.5 μL(引物浓度为10 μmol/L)，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，Pfu DNA聚合酶 2 μL，ddH2O 37 μL.PCR 反应条件：98 ℃ 3 min，98 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，35 个循环，72 ℃ 5 min.PCR反应产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测后，由武汉擎科生物技术有限公司进行测序，测序采用Sanger一代测序法.测序结果16S rRNA序列使用SnapGene拼接，将序列在NCBI上比对，根据同源性判断其所属.筛选到的18种菌株进化树图使用软件MEGA7邻接法进行分析.

1.2.5 菌株降解有机磷能力测定 甲基膦酸酯被微生物降解后产生磷酸盐，使用磷钼蓝法检测培养基中磷酸盐的含量来评估菌株降解效果和正磷酸盐的释放情况，同时测定培养基在波长600 nm处吸光值制作生长曲线来判断菌株生长情况.

1.2.6 磷钼蓝法 配制反应液：3.000 g 钼酸铵溶于100 mL ddH2O制成钼酸铵溶液，70 mL H2SO4溶入430 mL ddH2O制成稀硫酸溶液，1.320 gL-抗坏血酸溶于50 mL ddH2O制成抗坏血酸溶液，0.034 g 酒石酸锑钾溶于25 mL ddH2O制成酒石酸锑钾溶液.将反应液按比例混成Mix溶液(50 mL)：10 mL钼酸铵溶液、25 mL稀硫酸溶液、10 mL抗坏血酸溶液、5 mL酒石酸锑钾溶液，混合均匀，现配现用.按反应体系进行反应，500 μL样品+5.50 mL ddH2O+960 μL Mix溶液.体系混匀反应5 min后测定反应体系在波长880 nm处吸光值，使用ddH2O作为样品的反应溶液进行空白对照校正.反应之前使用KH2PO4作为标准品制备标准曲线.

2 结果

2.1 菌株鉴定

2.1.1 菌株筛选鉴定结果 将5 mmol/L甲基膦酸酯无机盐固体平板上分离纯化得到的单菌落使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，送公司测序获得序列进行16S rRNA鉴定，将16S rRNA序列与NCBI 数据库比对，共得到18株菌株，如图2所示.根据菌株在含有5 mmol/L甲基膦酸酯平板上的生长情况(表1)，选出较好的3株分别单独培养，测定菌株在pH为7, 温度为28 ℃下的生长曲线及培养基中磷酸盐释放曲线，如图3所示.在相同条件下，伯克氏菌属的一株菌相对于其他菌生长状态最好，培养基中磷酸盐释放浓度最高，其最大OD600值达到3.2，培养基中释放的无机磷浓度为290 μmol/L.NCBI网站比对16S rRNA结果与伯克氏菌相似性为99%，命名为Burkholderiastrain HQL1813.注册16S rRNA GenBank登录号为MK044746.1.为了后续研究及应用，菌株HQL1813已于中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813，保藏编号：CCTCC NO：M 2018708，保藏地址：中国武汉，武汉大学.

图3 生长较好的3株菌生长曲线和培养基中磷酸盐释放浓度曲线培养基为含5 mmol/L甲基膦酸酯的无机盐培养基，培养体系为50 mL，培养条件为pH 7、28 ℃.对照为相同条件下空白对照，无明显生长和甲基膦酸酯降解

表1 筛选得到的18种降解甲基膦酸酯的菌株生长情况

图1 16S rRNA序列PCR扩增产物电泳检测图1～18分别为不同单菌落16S rRNA序列扩增的PCR产物，M：DNA Marker

图2 筛选得到的18种降解甲基膦酸酯的菌株进化树图

2.1.2 菌株Burkholderiastrain HQL1813形态特征观察 伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813在含有甲基膦酸酯的无机盐固体平板上划线培养后单菌落为淡黄色的圆形，单菌落用水稀释后革兰氏染色被染成紫红色，为革兰氏阴性菌，呈棒状，如图4所示.

图4 革兰氏染色后显微镜下观察(4 000倍)

2.2 菌株Burkholderiastrain HQL1813 降解MPn的特性分析

2.2.1 温度对菌株的影响 配制含有5 mmol/L甲基磷酸酯(pH为7)的无机盐液体培养基，培养体系为50 mL，接种HQL1813后分别于18 ℃、28 ℃和37 ℃，250 r/min摇床培养，同时测定其生长曲线以及培养基中磷酸盐释放曲线(图5).

图5 菌株Burkholderia HQL1813在不同温度条件下培养时的生长曲线和培养基中磷酸盐释放浓度曲线培养体系为50 mL(pH为7)

从图5可以看出，该菌株在18 ℃和28 ℃培养时均可以生长，37 ℃不生长.在18 ℃培养时菌株生长较慢，直到100 h后才开始生长，140 h后进入对数期，同时开始释放磷酸盐到培养基中，培养基中磷酸盐浓度为50 μmol/L.该菌株在28 ℃时生长情况最好，50 h后进入对数期，并且释放磷酸盐到培养基中.随着菌株的生长，28 ℃培养的菌株最大OD600值达到4.89，培养基中磷酸盐逐渐积累，最大磷酸盐浓度达到228 μmol/L.该菌株的最适生长温度为28 ℃，18 ℃缓慢生长，37 ℃不生长.

2.2.2 pH对菌株降解MPn能力的影响 配制含有5 mmol/L甲基磷酸酯的无机盐液体培养基，培养基体系为50 mL，pH分别调为5、7和9，接种HQL1813后于28 ℃，250 r/min摇床培养，同时测定其生长曲线以及培养基中磷酸盐释放曲线(图6).

图6 菌株Burkholderia HQL1813在不同pH条件下生长曲线和培养基中磷酸盐释放浓度曲线培养体系为50 mL，28 ℃

从图6可以看出菌株BurkholderiaHQL1813在pH为5和7时均可以生长，而pH 9时无法生长.其中，培养基中磷酸盐的释放伴随着整个生长周期并且逐渐累积.pH为7时菌株生长情况最好，最大OD600值达到2，pH为5时最大OD600值为1.5.pH 5时培养基中磷酸盐浓度最终达到90 μmol/L.pH为7时培养基中磷酸盐浓度最终达到120 μmol/L以上.该菌株最适生长pH为7，pH为5时相对生长情况较差，pH为9时不生长.

3 讨论

目前，人们已分离出多种能降解有机磷农药的微生物菌群，细菌在微生物降解中占有重要地位，大多数分离到的细菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等.而Tiwari等[18]分离出一株对有机磷农药甲基对硫磷有较好去除和降解效果的蓝藻，Melissa等[19]也发现一株高温聚球藻可以在以甲基膦酸酯为唯一磷源的培养基中生长.分离得到高效有机磷降解菌后可以使用基因工程手段来提高其降解效果，邓敏捷等[20]从产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)中克隆得到有机磷降解基因ophc2并在大肠杆菌中验证其生物学功能.另外，研究表明微生物降解有机磷有广谱性，一种微生物可以降解多种有机磷.江玉姬[21]以及Kazufumi等[22]均发现了可以降解多种有机磷的菌株，Brajesh等[23]利用菌株EnterobacterB-14进行了污染土壤修复的研究，表明微生物在土壤修复以及有机磷降解方面有潜在应用[24].

本实验从土壤样品中，利用甲基膦酸酯作为唯一磷源筛选得到18株可以降解甲基膦酸酯的菌株，其中生长和降解效果最好的是Burkholderiastrain HQL1813.本研究对该菌株进行了鉴定以及降解甲基膦酸酯特性分析，该菌株属于伯克氏菌(Burkholderia),生长的最适温度为28 ℃，最适pH为7.根据生长曲线和培养基中磷酸盐释放浓度曲线可以看出伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813在含有甲基膦酸酯的培养基中生长良好，具有降解甲基膦酸酯的能力.该菌株在培养条件下80 h后最大OD600值可以达到4.89，在培养100 h后培养基中无机磷浓度达到228 μmol/L，能够将甲基磷酸酯降解为磷酸盐.和其他降解菌报道[7]相比，本研究中磷酸盐释放率偏低，分析甲基膦酸酯被降解后只计算了释放到培养基中转化为无机盐的部分，而微生物利用转化为细胞生物量的部分未计算，同时培养基中有机磷浓度也可能影响其生长.该菌除了在有机磷土壤污染方面的潜在应用外，还可以用于自然环境科学中磷的迁移变化规律、有机磷微生物降解机理的研究.