葫芦巴碱的预防性使用可减轻妊高症大鼠模型的症状并保护胎儿生长和血管内皮功能

史许锋,刘 侃,王 莉,王焕萍,张敬丽,武海英

(河南省人民医院产科,郑州 450003)

子痫前期(preeclampsia,PE)是一种严重的母体炎症性疾病,具有内皮细胞功能障碍,尚缺乏有效的治疗和预防方法。子痫前期是一种妊娠特异性综合征,全球发病率在2%~8%之间,是导致早产、孕产妇死亡的主要原因[1-2]。PE定义为妊娠20周或之后伴有新发蛋白尿,子宫胎盘功能障碍或其他母体器官功能障碍的妊娠高血压[3]。除终止妊娠外,尚无有效的PE治疗方法,对PE高风险孕妇的预防措施也很有限[4]。此外,有PE病史的女性患心血管疾病的风险更高[5]。因此,预防PE对预防女性心血管疾病具有重要意义。

PE的发病机制仍不清楚,有证据表明它与局部和全身性血管内皮损伤以及炎症的过度活化有关[6]。PE患者胎盘中抗血管生成分子和炎性因子分泌明显增加,从而导致内皮表面分子模式的急剧变化,并导致全身性内皮功能障碍、血管收缩和随后的高血压[7]。因此,调节抗血管生成因子的平衡,减少过度的炎症激活以及保护内皮功能是治疗和预防PE的关键目标。葫芦巴碱(trigonelline)为传统中药益母草的有效成分,具有抗氧化、保护心肾、提高生育等作用,以往研究指出,葫芦巴碱的使用可以通过JAK/Stat3等信号通路而抑制炎症机制的过度激活,促进血管新生,并通过NO-cGMP途径起血管舒张作用,最终发挥血管保护作用[8]。此外,在异氟醚麻醉的小鼠模型中,葫芦巴碱的预防性使用可以抑制异氟醚麻醉诱导的心肌凋亡[9]。然而,预防性使用葫芦巴碱对于PE症状的治疗作用尚未见报道,因此,本研究旨在确定妊娠早期使用葫芦巴碱对于一氧化氮合酶拮抗剂N-硝基-1-精氨酸甲酯(LNAME)诱导的PE大鼠的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠28只,8~10周龄,体重200~220 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006),将大鼠饲养于郑州大学动物实验中心[SYXK(豫)2019-00013]。温度控制在(23±3)℃,湿度(50±10)%和光照-黑暗周期(12 h∶12 h)的条件下,自由进食和饮水。本实验的研究过程遵循实验动物3R原则。本研究经我院医学伦理委员会批准((2019)伦审第(38)号)。

1.2 主要试剂与仪器

LNAME(江蓝纯生物试剂有限公司,中国);葫芦巴碱(安诺伦生物科技有限公司,中国);CMC(安诺伦生物科技有限公司,中国);高碘酸席夫(Schiff,美国);PrimeScript RT试剂盒(成都灵动生物技术有限公司,中国);TB Green Premix Ex Taq II(Takara Biotechnology,日本);总蛋白提取试剂(维润赛润生物试剂有限公司,中国);聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美国);HPR偶联的二抗(博拓生物科技股份有限公司,中国);sFlt-1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、PlGF ELISA试剂盒,NO ELISA试剂盒,eNOS ELISA试剂盒,TNF-αELISA试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒(试剂盒均购置于利翰生物科技有限公司,中国);光学显微镜(Leica Microsystems,德国);MS550D换能器和Visual Sonic超声系统(Visual Sonic,美国);ABI Prism 7300系统(Applied Biosystems,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 治疗方法

将雌性大鼠与雄性大鼠(2∶1)交配,并且检测到阴栓时记为妊娠日GD 0,然后将雌性大鼠从GD 0随机分为四组,每组7只。对照组:GD 9-20时通过经口管饲法给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC);LNAME组:GD 9-20时皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME[10];低剂量葫芦巴碱组(LT组,n=7):GD 9-20时皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以2 mg/(kg·d)的剂量经口管饲法给予葫芦巴碱-20溶于CMC;(4)高剂量葫芦巴碱组(HT组):GD 9-20时皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以10 mg/(kg·d)的剂量经口管饲法给予葫芦巴碱-20(溶于CMC)。

LNAME是一种一氧化氮合成酶抑制剂,孕鼠注射LNAME可产生与人类PE类似的表型,主要表现在高血压和蛋白尿,通过上述可以判断PE模型的情况。

1.3.2 血压测量

使用无创自动血压分析仪(第一三共株式会社,日本)通过尾袖法[11]在有意识大鼠中测量收缩压(SBP),舒张压(DBP)和平均动脉压(MAP)。

1.3.3 蛋白尿监测

在GD 0和GD 18时采用代谢笼收集24 h的尿液,将样品储存在-80℃并进行分析以评估蛋白质浓度(Thermo Scientific,美国)。

1.3.4 高频超声成像

在GD 19时使用高频超声成像检测母体血流介导的股动脉扩张(FDM)和股动脉壁切应力(WSS),使用MS550 D换能器和Visual Sonic超声系统获得图像,测量值(静态图像和视频剪辑/电影循环)以数字方式存储,用于脱机分析血流介导的扩张[12]。

1.3.5 组织取样

在GD 20时脱颈处死检查子宫的胎盘和胎儿的重量和长度,同时切除母鼠肾,将胎盘和肾转移到液氮中,并保存在-80℃进行Western blot印迹或聚合酶链反应(PCR)分析,或保存在4%多聚甲醛中进行组织学检查。

1.3.6 组织学和免疫组化

将胎盘组织样品在4%多聚甲醛中固定48 h,包埋在石蜡中,切成5μm厚的切片,并用苏木精和曙红染色;将肾组织切成3μm厚的切片,用高碘酸席夫染色后评估肾小球硬化指数[13]。

对于免疫组织化学,将切片与抗大鼠抗p-NFκB p65(Abcam,英国,1∶500)抗体一起孵育,使用光学显微镜进行显微镜分析,通过Image J对结果进行定量分析。

1.3.7 sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6激活测定

在GD 20时从主动脉收集血液到抗凝管中,以2000 r/min离心15 min分离血浆,根据制造商的说明,使用sFlt-1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、PlGF ELISA试剂盒、NO ELISA试剂盒、eNOS ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒测量sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6的血浆浓度。

1.3.8 实时定量PCR

按照制造商的说明使用TRIzol提取组织总RNA,通过Agilent 2100生物分析仪检测RNA的完整性,使用PrimeScript RT试剂盒从等量的不同样品RNA中合成cDNA,并使用TB Green Premix Ex Taq II用于进行PCR反应,以GAPDH用作内部对照,通过ABI Prism 7300系统测量TNF-α、IL-6、NF-κB p65和GAPDH的表达。引物组的序列列于表1。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.9 蛋白质印迹分析

按照制造商的说明使用总蛋白提取试剂提取组织总蛋白,在100℃下加热5 min,将蛋白质裂解物(35 mg)在Tris-甘氨酸缓冲的10%SDS-PAGE上通过电泳分级分离,并将印迹转移到聚偏二氟乙烯膜上,将膜在室温下封闭2 h,然后与p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65和NF-κB p65的相应一抗孵育过夜,随后将膜与HPR偶联的二抗在室温下孵育1 h,将蛋白质表达标准化为GAPDH的表达,使用增强化学发光法(ECL,Keygen)检测蛋白信号,并使用Image J 2x软件分析条带。

1.4 统计学方法

数据分析使用SPSS 24.0(美国SPSS Inc.)进行,结果表示为平均数±标准差(±s)。如果数据呈正态分布且具有均一的方差,则使用t方差单向分析后通过最低显著性差异(LSD)进行t检验,以计算各个研究组之间的差异;方差不一致时,则使用Dunnett T3分析组之间的差异。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葫芦巴碱可预防PE大鼠的妊娠高血压,蛋白尿,低母体体重和胎鼠生长受限

妊娠初期四组血压无明显差异,在GD10时,LT和HT组的血压显著低于LNAME组的血压,且LT和HT组的血压在整个怀孕期间仍与对照组相似(P＞0.05,图1A、1B、1C);此外,GD 0时四组蛋白尿之间无显著差异(P＞0.05),而在GD18上,LT和HT组的蛋白尿明显低于LNAME组(P＜0.001),LNAME组的蛋白尿明显高于对照组(P＜0.001),LT,HT和对照组之间则无显著差异(P＞0.05,图1D)。Control组胎儿数量(11.5±1.7)与L-NAME组(12.4±0.8)、LT组(11.8±2.1)、HT组(12.6±1.6)之间无显著差异(P＞0.05)。LNAME组的体重降低,胎儿身长(P＜0.001)和体重(P＜0.01)显著低于其他组,而LT和HT组母体体重和胎鼠生长被明显保护(图1E、1H、1I),四组胎盘直径或重量无显著差异(P＞0.05,图1F)

图1 葫芦巴碱对子痫前期症状的影响(¯x±s)Note.A~C,Blood pressure in four groups of pregnant rats.D,Proteinuria.E,Weight gain in pregnant rats.F,Placental length.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,###P＜0.001.Figure 1 Effect of Trigonelline on preeclampsia

2.2 葫芦巴碱可以缓解PE样大鼠的胎盘和肾组织学损伤

对照组的胎盘迷路区规则且血液丰富,而LNAME组大鼠胎盘迷路区混乱并存在合胞性结节,这些结节可能阻碍胎盘的血液供应并降低胎盘的功能,在预防性使用葫芦巴碱后,大鼠胎盘迷路区显示出明显的改善,结节数量明显减少(图2A,P＜0.001),此外,LNAME组的肾小球硬化指数显着高于对照组,与LNAME组相比,LT和HT组的肾小球硬化指数被明显改善(P＜0.01,图2B、2C)。

图2 葫芦巴碱减轻LNAME诱发的先兆子痫样大鼠的胎盘和肾的形态损伤(¯x±s)Note.A,HE staining images of placenta(n=4,Keywords syncytial nodules marked with arrows).B,PAS staining images of the kidneys(Glomerular sclerosis marked with arrows,n=3).C,Glomerular sclerosis index(n=3).Compared with control group,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 2 Trigonelline attenuates LNAME induced morphological damage to the placenta and kidneys in preeclampsia rats

2.3 葫芦巴碱可改善PE大鼠血浆中的内皮依赖性血管舒张,内皮功能生物标志物和平衡的血管生成分子

四组大鼠基线股动脉直径差异无统计学意义(图3A、3B,P＞0.05),缺血5 min后,对照组,LT组和HT组的FMD随时间逐渐增加,在120 s达到峰值,LNAME组在240 s达到峰值,LNAME组的FMD峰值显着低于对照组,LT和HT组(图3C);此外,四组之间基线WSS没有显著差异,缺血后四组WSS随时间变化,与LNAME组相比,葫芦巴碱使LT和HT组的WSS明显降低(图3D)。

图3 葫芦巴碱对内皮功能和血管生成因子的影响(¯x±s)Note.A,Femoral artery diameter in four groups of rats.B,Pulse Doppler images.C,Blood flow-mediated dilation.D,Wall shear stress.E,NO in plasma.F,eNOS.G,sFlt-1.H,PlGF.I,sFlt-1/PlGF ratios.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.001,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 3 Effects of Trigonelline on endothelial function and angiogenic factors

与LNAME组相比,LT和HT组的血浆NO恢复到正常水平,与对照组相似(图3E,P＞0.05),血浆eNOS水平得到改善(图3F,P＜0.001),与LNAME组相比,LT和HT组的血浆sFlt-1水平显着降低(图3G),HT组的血浆PlGF值恢复至与对照组相似的水平(图3H,P＞0.05),同时,LT和HT组的sFlt-1/PlGF比率明显低于LNAME组的比率(图3I,P＜0.001)。

2.4 葫芦巴碱可以抑制PE样大鼠血浆和组织中炎性细胞因子的释放

LNAME诱导的大鼠的血浆TNF-α和IL-6水平显着高于对照组(P＜0.01),而LT和HT组的血浆水平显着降低(P＜0.01,图4A、4B),与对照组相比,LNAME组血浆与肾中TNF-α和IL-6的mRNA水平显着增加(P＜0.001),而LT和HT组TNF-α和IL-6的mRNA水平明显降低,且HT组的表现优于LT组(图4C、4D、4E、4F)。

图4 葫芦巴碱的预防性给药可以下调血浆,胎盘和肾中的炎性细胞因子(¯x±s)Note.A/B,Levels of TNF-αand IL-6 in plasma of four groups of rats.C/D,Expression of TNF-αand IL-6 mRNA in rat placenta of four groups.E/F,TNF-αand IL-6 mRNA expression in the kidney of four groups of rats.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 4 Prophylactic administration of Trigonelline can downregulate inflammatory cytokines in plasma,placenta and kidney

2.5 葫芦巴碱可抑制PE大鼠胎盘中的炎症

免疫组织化学分析显示,LT和HT组的胎盘中p-NF-κB水平明显低于LNAME组(P＜0.001),NFκB的mRNA表达明显降低(P＜0.001),而HT组的表现优于LT组(图5A、5B、5C),此外,与LNAME组相比,葫芦巴碱组中p-IκBα与IκBα的比率以及NF-κB与p-NF-κB的比率显着降低(图5D、5E、5F、5G,P＜0.001),这些数据表明葫芦巴碱抑制LNAME诱导的PE样大鼠胎盘中的炎症可能与IκBα/NFκB信号通路有关。

图5 葫芦巴碱抑制PE大鼠胎盘中的IκBα/NF-κB信号通路(¯x±s)Note.A,Immunohistochemical staining of placental tissue p-NF-κB in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the placenta.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-NF-κB to IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to IκBα.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 5 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat placenta by Trigonelline

2.6 葫芦巴碱可以抑制PE大鼠肾的炎症

免疫组织化学分析显示,LT和HT组的肾中p-NF-κB与NF-κB的mRNA水平明显低于LNAME组(P＜0.01),而HT组的表现优于LT组(图6A、6B、6C),此外,与LNAME组相比,葫芦巴碱组中p-IκBα与IκBα的比率以及NF-κB与p-NF-κB的比率显着降低(图6D、6E、6F、6G,P＜0.01)。这些数据表明葫芦巴碱抑制LNAME诱导的PE样大鼠肾的炎症可能与IκBα/NF-κB信号通路有关。

图6 葫芦巴碱抑制PE大鼠肾中的IκBα/NF-κB信号通路(±s)Note.A,Immunohistochemical staining p-NF-κB renal tissue in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the kidneys.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-IκBαto IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to NF-κB.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared to the LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 6 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat kidney by Trigonelline

3 讨论

由于妊娠期间宫内暴露于高血压,妊娠高血压的母亲及其后代都有长期的心血管后遗症,因此,患有PE高危因素的孕妇的患者应进行预防性干预[14-15]。但是,预防PE的措施是有限的,而阿司匹林是唯一具有可靠预防PE的药物[16]。研究表明[17],PE与炎症反应和内皮功能障碍有关,葫芦巴碱可以通过抑制炎症舒张血管平滑肌而发挥内皮功能保护作用。因此,在这项研究中,我们使用葫芦巴碱进行PE的预防性治疗。

葫芦巴碱的预防性给药可预防LNAME诱导的PE样妊娠大鼠的高血压,同时降低孕鼠尿蛋白,将胎盘的长度和重量恢复至正常水平,此外,由于葫芦巴碱可以缓解胎儿生长限制,孕期孕鼠的体重增加相应增加,此外,在妊娠早期服用葫芦巴碱时,血压不低于正常水平,这表明葫芦巴碱不会因降低血压而降低母体灌注。最后,胎盘和肾的组织学检查表明葫芦巴碱起保护作用,而蛋白印迹和PCR分析提示葫芦巴碱的保护作用与IκBα/NF-κB途径抑制相关。

葫芦巴碱的预防性给药可预防LNAME诱导的PE样妊娠大鼠模型中血流介导的FMD峰值明显较低,而FMD是一种通过测量短暂性脑缺血后动脉直径的变化来评估内皮功能的技术,与使用内皮素,一氧化氮和其他生物标记物相比,FMD具有无创,可靠且具有系列特征的特点,被广泛用于评估内皮功能,或者怀孕期间的心血管风险[18]。葫芦巴碱改善可以内皮舒张功能从而表现为FMD峰值的增加,同时降低血管壁的切应力,并恢复NO和eNOS的血浆水平,改善由LNAME诱导的PE样大鼠的内皮功能障碍。PE的病理机制与异常循环血管生成因子有关,可溶性酪氨酸激酶-1(sFlt-1)与循环的PlGF和VEGF结合,从而降低其在子宫胎盘和母体循环中的水平,导致内皮功能障碍,血管收缩和高血压[19-20]。本研究的结果显示,葫芦巴碱改善孕鼠sFlt-1和PlGF的平衡,并降低了sFlt-1/PlGF,表明葫芦巴碱可以保护LNAME诱导的PE样大鼠的内皮功能。与健康对照组孕妇和非孕妇相比,PE妇女的TNF-α和IL-6水平显着升高,并导致内皮功能障碍[20]。近期文献报道[21],甲醛吸入可引起小鼠肺和全身损伤,而葫芦巴碱的给药可降低血浆中的TNF-α,IL-6和KC/GRO水平,并降低胎盘中TNF-α的表达。我们的数据表明,葫芦巴碱的预防性给药可降低血浆中TNF-α和IL-6的水平,同时抑制LNAME诱导的PE样大鼠模型的胎盘和肾脏中TNF-α和IL-6的表达,这表明葫芦巴碱可降低LNAME诱导的PE模型中的炎性细胞因子。NF-κB是调节炎症的重要因素,它在炎症反应的激活中起着关键作用,而炎症反应涉及许多重要的人类疾病[22],例如心血管疾病和PE,此外,研究表明[23],NF-κB信号的激活加剧妊娠孕妇的内皮功能障碍。本研究的结果指出,葫芦巴碱对胎盘和肾的保护作用可能与IκBα/NF-κB信号通路有关,通过抑制其表达和激活而降低胎盘和肾的炎症状态。

总之,本研究的结果表明,葫芦巴碱在LNAME诱导的PE样大鼠模型中的预防性使用可减轻PE症状,促进胎儿生长,保护内皮功能并抑制IκBα/NF-κB途径以减少炎症反应。