高原链带藻抗氧化蛋白分离纯化与结构鉴定

孔婉莹 李旭 洪瑜 胡云龙

众所周知，人类一切疾病的根源都是因为自由基，自由基会影响细胞的活性，严重的还会杀灭细胞，因此，要想保证人体健康，就必须要清除自由基，而抗氧化物则可以有效地解决这一问题。抗氧化物通过清除体内的自由基，同时减少组织氧化，以此来达到保护机体的最终目的。天然的抗氧化物相較于合成物而言，有着更好的应用效果，其副作用小，同时能够降低免疫系统活性的干扰，因而有着更好的促氧化效果。

高原链带藻是从我国西藏那曲青龙乡普保巴村巴木错湖分离得到的，经过初步的实验研究发现，高原链带藻在常温常压的条件下进行培养，其在培养基中生长6d之后，藻类细胞中的蛋白质含量达到了71.68%，同时对蛋白粗提取物进行测试后发现，其蛋白具有一定的抗氧化性，能够有效地对氢氧根离子以及DPPH自由基进行清除，且清除能力较强。本文中主要针对高原链带藻抗氧化蛋白的分离纯化及结构鉴定进行分析，利用柱层析方法进行高原连带藻蛋白的分离纯化，并结合质谱技术进行蛋白结构的测试，以此来对高原链带藻抗氧化蛋白进行更为深入的检测研究。

一、材料与方法分析

1.高原链带藻的培养及蛋白粗提取。在进行高原链带藻的培养过程中，首先在500mL的摇瓶中加入250mL的BG11培养液，进行接种时其浓度为1×106个/mL，同时培养条件为温度（25±1）℃，光照条件为108μmol/（㎡·s），光暗周期则为12L。在该培养条件下培养6天后进行抽滤操作，收集所需要的高原链带藻细胞，将之进行冷冻处理，备用。

在进行高原链带藻抗氧化蛋白的粗提取时，首先需要取冻干的微藻细胞粉末50mg放入研钵中，在冰水浴的条件下进行研磨，取其上清液，利用缓冲溶液定容，最后加入硫酸铵直到其饱和度的80%，搅拌均匀后待用。静置30min之后，收集蛋白沉淀并用磷酸缓冲液进行再次溶解，再经过后续一系列的操作后便完成了蛋白的粗提取。

2.高原链带藻抗氧化蛋白的分离纯化。进行抗氧化蛋白的分离纯化时，需要使用到AKTA Prime蛋白纯化系统进行操作。在此过程中，首先将蛋白的浓缩液浓度调节为20mg/mL，并在填料柱上样1mL，使用氯化钠溶液溶于磷酸缓冲液进行梯度洗脱，控制好洗脱的流速，由此来收集各峰的组分。收集到各个部分的组分之后，需要使用磷酸缓冲溶液进行再次溶解，将蛋白的浓度控制在8mg/mL，再用1mol/L的氯化钠和氢氧化钠溶液分别冲洗，由此便将所得到的抗氧化蛋白进行了再次的分离纯化，所得到的最终产品也更为纯净。

3.高原链带藻结构的鉴定分析。进行高原链带藻抗氧化蛋白结构的鉴定分析时，首先需要将10μg纯化后的抗氧化蛋白用50mmol/L的TEAB缓冲溶液复溶，之后加入0.2μg的混合酶液，在37℃的条件下进行酶解，6h之后将产物多肽进行低温真空干燥，并使用乙腈溶液进行复溶，产物进行二级质谱分析，即利用相关软件对质谱图所对应的多肽段序列进行分析。在一级结构的基础上还可以使用Phyre2在线程序进行高级结构的模拟分析。

二、结果与分析

1.高原链带藻抗氧化蛋白的分离纯化。高原链带藻抗氧化蛋白的分离纯化都是在4℃的条件下进行的，经过离子交换柱的分离之后，得到了3个主要的蛋白峰，且洗脱体积为22-77mL时洗脱液显示了抗氧化活力。在此过程中，抗氧化蛋白也得到了较好的分离，其总质量为5.7mg。

2.抗氧化蛋白处理对于细胞MDA水平和SOD、CAT活力的影响。实验结果显示，氧化胁迫能够促使产生细胞毒性物质MDA，由此便破坏了细胞膜的完整性，同时也会导致SOD和CAT失活，这三方面的指标都能在一定程度上反映出细胞受到自由基攻击的程度，经过过氧化氢处理后的细胞中，MDA、SOD以及CAT的含量都有所变化，其具体的影响如表1所示。

3.高原链带藻抗氧化蛋白结构。通过质谱分析可知，高原链带藻抗氧化蛋白主要是由408个氨基氨基酸按照一定序列所组成的，且经过ExPasy在线程序的分析显示，其蛋白质分子量为44.8kD。

本文中对于高原链带藻抗氧化蛋白的分离纯化及结构鉴定进行了分析探讨，由此对于高原链带藻有了更为深入的认识。