安徽省太和县瓜类褪绿黄化病毒自然侵染南瓜的检测分析

陈莹 韩科雷 章东方 顾江涛 高正良 郭志 严丹侃 王芳

摘要 采集安徽省太和县南瓜具有典型症状的病叶样品进行RT-PCR检测鉴定，并结合测序结果确定为CCYV。为了更加明确安徽太和地区CCYV的来源和序列的变异情况，测定了该病毒的外壳蛋白（coat protein，CP）序列进行系统发育分析，结果表明，此次安徽太和县所检测到的分离物与我国其他地区的分离物以及以色列、日本和希腊等国家存在较小的地域差异性，亲缘关系较近，而与伊朗地区的分离物亲缘关系相对较远。该研究是安徽省CCYV侵染南瓜的首次报道，以期为该病害的预警和防控提供理论基础和科学对策。

关键词 南瓜;瓜类褪绿黄化病毒;系统发育分析

中图分类号 S 436.42  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）16-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.042   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Detection and Analysis of Cucurbit  Chlorotic Yellow Virus Naturally Infecting Pumpkin in Taihe，Anhui Province

CHEN Ying， HAN Ke-lei， ZHANG Dong-fang et al

（Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract We collected samples of diseased leaves with typical symptoms for RT-PCR detection and identification， and combined the sequencing results to determine that it was CCYV. In order to more clarify the source and sequence variation of CCYV in Taihe， Anhui Province， the coat protein （CP） sequence of the virus was determined for phylogenetic analysis. The results showed that the isolates detected in Taihe， Anhui Province were relatively close to isolates from other areas of China， Israel， Japan， and Greece. The relationship with the isolates in Iran was relatively distant. This study was the first report of CCYV infestation of pumpkins in Anhui Province， in order to provide a theoretical basis and scientific countermeasures for the early warning and prevention of the disease.

Key words Pumpkin;Cucurbit chlorotic yellows virus;Phylogenetic analysis

瓜类褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（ Crinivirus ），由2种类型的烟粉虱（B型和Q型）半持久性传播[1-2]，不能够通过摩擦接種传播。CCYV在自然条件下可侵染多种瓜类作物，如西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜等[3-6]。CCYV最早是2004年日本学者在一个甜瓜的温室大棚中发现，但其基因组序列是2010年才被鉴定出来[5]。我国2019年被首次报道（湖南省）CCYV在自然条件下侵染南瓜。虽然该病毒是毛形病毒属近几年新加入的成员，但其危害范围较广，蔓延速度较快，在伊朗[7]、黎巴嫩[8]、希腊[9]和苏丹[10]等国家均有发生危害，此外在我国如上海[11]、台湾[12]、山东[13]、新疆[4]、河南和海南[14]等地也均有报道。CCYV主要危害瓜类作物的叶片，症状表现为花叶、黄化和卷曲等，严重时导致整株坏死，颗粒无收[15]。

目前关于CCYV可以侵染南瓜的报道不多，调查发现在安徽太和县温室内发生在南瓜上的CCYV侵染十分严重，该病毒侵染南瓜后植株叶片表现出褪绿畸形，无法结出果实，严重影响了该地南瓜的产量和品质，造成大量的经济损失。因此，为了明确安徽省太和县CCYV侵染南瓜的发生情况和遗传变异等问题，笔者利用RT-PCR的方法对其CP序列进行扩增检测，并将本地的分离物与其他地区已报道的分离物进行系统发育分析，为安徽省太和县CCYV发生情况和病害防控提供了数据支撑。这是继我国湖南省报道的CCYV可以在自然条件下侵染南瓜后的第二次报道，同时这是安徽省CCYV可以在自然条件下侵染南瓜的首次报道。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年10月，在安徽省太和县旧县镇精准扶贫就业基地的南瓜温室中，南瓜表现出大面积的叶片褪绿、黄化、坏死及植株矮化等症状，造成整个温室的南瓜颗粒无收，采集具有典型病毒病症状的带毒样品，对其样品进行编号后置于液氮中速冻，并保存于-80 ℃超低温冰箱，待进行后续实验室内检测鉴定。

1.2 检测方法

1.2.1 RT-PCR 检测。

根据该基地温室中南瓜叶片的发病症状以及温室大棚中出现烟粉虱等传毒介体，推测其可能受CCYV的侵染，因此根据NCBI中所报道的CCYV CP序列设计特异性引物，进行RT-PCR检测。将采集的带毒样品进行充分研磨后，参照TIANGEN植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit进行植物总RNA提取，然后根据Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ说明书操作（购于艾科瑞生物有限公司），对所提取的RNA样品进行反转录。以反转录合成的cDNA为模板，利用2×Mix（购于北京艾德莱生物有限公司）进行RT-PCR扩增检测。上游引物CCYV-CP-F：5′-CGTAAGTGATCGCAATCAAT-3′;下游引物CCYV-CP-R：5′-AGTGATCACTTGACCATCTCC-3′。扩增片段长度为876 bp。反应条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送至南京生工生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST进行比对。

1.2.2 系統发育分析。

采用MEGA 7.0软件进行系统发育分析，使用邻接法（neighbor-joining）建树，Bootstrap replications中输入1 000，序列比对时选择氨基酸（amino acid），由此完成建树[16]。

2 结果与分析

2.1 CCYV发生情况

对安徽省太和县旧县镇精准扶贫就业基地的南瓜温室进行了调查分析。温室内南瓜产区病毒病发生十分严重，并出现烟粉虱等传毒介体，受病毒病侵染的南瓜叶片表现为褪绿黄化、皱缩、畸形、坏死，且植株矮化，不结果实。典型症状见图1。

2.2 CCYV的RT-PCR检测鉴定

将采集的4组表现病毒病症状的样品进行病毒检测，根据合成的CCYV特异性引物进行RT-PCR验证，检测结果发现，采集的4组样品中，有一组样品检测出相应条带，条带大小为876 bp（图2）。PCR产物通过测序后，确定为瓜类褪绿黄化病毒。通过Blast比对后，CCYV CP 序列全长753 bp，编码250个氨基酸，且发现该次检测到的CCYV CP序列与登录号为KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1的CP序列完全一致。该分离物CP核苷酸序列与其他地区已报道的分离物核苷酸序列同源性在94.82%～99.87%，这是安徽省CCYV自然侵染南瓜的首次报道，后续对于该基地南瓜的发病情况也会持续调查和研究。

2.3 CCYV的CP序列系统发育分析

为明确安徽省太和南瓜CCYV的分类地位以及与各地区所报道的同种病毒不同寄主之间的亲缘进化关系，将检测到的CCYV CP序列结合已报道的29个 CCYV CP序列进行系统发育分析，并将bean yellow disorder virus分离物（登录号：EU191905.1）作为外群一起构建系统发育树（图3）。结果发现，CCYV的不同分离物在不同地区具有一定的地理特征。中国各地区的分离物与日本、塞浦路斯、以色列和希腊地区的分离物差异较小，亲缘关系较近，而与伊朗地区的分离物亲缘关系较远，分别属于2个不同的分支。此外有些CCYV分离物虽然来源于同一地区，但由于发生的寄主植物不同，在分类地位上也存在一定的差异，如山东省在西瓜和丝瓜上所报道的CCYV分离物处于不同的分支。

3 结论与讨论

瓜类褪绿黄化病毒作为长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（ Crinivirus ）的新成员，近几年对瓜类等葫芦科作物造成较严重的侵害和损失[15]。自2010年CCYV被日本首次报道[5]，同年在我国台湾地区也检测到该病毒[12]，随后在2011年我国山东省、浙江省和上海市的西瓜、甜瓜和黄瓜上均检测到CCYV，且病害发生率在50%～100%[17-18]，给农业生产造成了严重损失。该研究通过RT-PCR检测，确定安徽省太和县南瓜上暴发的病毒为CCYV，这是安徽省CCYV侵染南瓜的首次报道。通过对CCYV CP序列与其他地区的分离物同源性进行比对分析，结果表明此次检测到的CCYV分离物与已报道的6个其他分离物核苷酸同源性为100%，登录号分别为KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1。核苷酸序列与伊朗地区的分离物同源性较差，为94.82%～95.09%，与其他地区已报道的分离物核苷酸同源性为97.79%～99.87%。构建系统进化树发现，该地区所检测的分离物与我国其他地区的分离物亲缘关系密切，与伊朗地区分离物亲缘关系较远。太和县旧县镇精准扶贫就业基地作为安徽省重要的农产品扶贫产业区，南瓜生产遭受CCYV危害十分严重，主要表现为南瓜叶片褪绿黄化皱缩畸形，影响果实生长，造成严重的经济损失。2014年苏丹地区报道了CCYV能够自然侵染南瓜[19]，但在2019年湖南省首次发现并报道了CCYV能够自然侵染南瓜[6]。因此，结合近几年各地CCYV的发生蔓延情况和基于该次调查的结果，应引起CCYV对南瓜生产方面的重视，积极有效地采用防治措施加以防治。同时安徽CCYV与已报道的CCYV基因组核苷酸和氨基酸序列变异较小，表明未来在抗性品种的选育方面可能较容易找到适合各地的抗病性设计靶标，该试验结果旨在为CCYV的防控和抗性育种等方面提供理论参考。

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