酿酒酵母PDC5基因的缺失对2-苯乙醇合成的影响及相关代谢改造

朱灵桓，徐沙，李由然，张梁，石贵阳*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)3(河北科技大学 食品与生物学院，河北 石家庄，050018)

2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)具有令人愉悦的玫瑰花香气，其物化性质稳定，天然存在于植物的花叶或其萃取的精油中，在食品、日化用品甚至医药等领域都具有广泛应用[1]。相比化学合成法产品质量差、植物提取法成本高，微生物发酵法原料廉价易得，反应条件温和，对环境友好，其产品相当于物理提取法产品的天然质量，又具备化学合成法成本低廉的应用潜力，因此逐步成为国内外2-PE生产研究的热点[2]。很多微生物天然具有合成2-PE的能力，如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[3]、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)[4]、毕赤酵母(Pichiapastoris)[5]、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[6]等。其中，酿酒酵母作为遗传背景清晰的模式菌株，具有较强的产醇能力，在发酵过程中对环境的胁迫因素耐受性较高，因此研究基础广泛，合成2-PE的主要途径与调控机制更为明确[7]。酿酒酵母合成2-PE的主要途径是以L-苯丙氨酸为底物，通过芳香族氨基酸的转氨作用，生成苯丙酮酸，或在(苯)丙酮酸脱羧酶的作用下生成苯乙醛，进而脱羧生成2-PE或脱氢生成苯乙酸，即埃里希途径(Ehrlich pathway)，又称艾氏途径[1, 8]，如图1所示。

图1 酿酒酵母中艾氏途径示意图Fig.1 Schematic diagram of Ehrlich pathway in Saccharomyces cerevisiae

在酿酒酵母的艾氏途径中，苯丙氨酸转氨酶是可逆酶，分别由基因ARO8和ARO9编码[9]。当培养基中氮源为芳香族氨基酸时，Aro8p起主要催化作用，并且具有广泛的底物选择性[10]。Aro9p是一种诱导酶，在细胞生长时的合成代谢中通常不表达，但是在aro8△突变株中可以催化L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生物合成，其转录水平受芳香族氨基酸的诱导[9, 11]，以及上游激活序列的激活[12-13]。酿酒酵母中已知存在5种具有催化苯丙酮酸生成苯乙醛的酶，分别为Aro10p、Pdc1p、Pdc5p、Pdc6p和Thi3p，它们之间存在着激活、抑制协同等复杂的相互调控作用[14-15]。其中，Aro10p是起主要作用的苯丙酮酸脱羧酶，PDC5基因编码酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶，能够催化丙酮酸脱羧生成乙醛，同时也具有苯丙酮酸脱羧酶活性[16-18]。在本实验室的研究中发现，缺失PDC5基因的酿酒酵母菌株合成2-PE能力有所提高，这在以往的研究中未见报道。基于此，本研究初步探索了编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC5的缺失对酿酒酵母产2-PE的影响，并通过基于艾氏途径的代谢改造策略进一步提高2-PE的产量。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

本研究所用的菌株和质粒如表1所示，S.cerevisiaeCICC 31906是本实验室筛选出的用作代谢工程改造的出发菌株，EscherichiacoliJM109用作增殖构建质粒宿主。

表1 本文中涉及的菌株和质粒Table 1 The main strains and plasmids used in this study

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 培养基成分

SOB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨20，NaCl 0.5，KCl 0.186，MgCl20.95，配制固体培养基时加入琼脂粉15，115 ℃灭菌20 min。YEPD培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，配制固体培养基时加入琼脂粉15，115 ℃灭菌20 min。发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，L-苯丙氨酸 6.7，酵母粉 4，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，微量元素浓缩液1 mL，用KOH调节pH至6.0，115 ℃灭菌20 min。微量元素浓缩液(g/L)：CuSO4·5H2O 0.05，FeSO4·7H2O 2，MnCl2·4H2O 0.2，CaCl2·2H2O 2，ZnCl20.5，用2 mol/L HCl溶液溶解并定容至1 L，4 ℃保存。

大肠杆菌的培养：必要时加入氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)或卡那霉素(Kanamycin, Kan)，用于转化子筛选或质粒保持，其在培养基的工作质量浓度为100、30 μg/mL。培养温度为37 ℃，培养条件为200 r/min过夜。酵母菌的培养：基因敲除过程中，必要时加入硫酸诺尔斯菌素(Nourseothricin, NTC)或潮霉素(Hygromycin B, Hyg)，用于基因缺失的转化子筛选，其在培养基的工作质量浓度分别为100、200 μg/mL。基因过表达菌株构建过程中，必要时加入博莱霉素(Zeocin, Zeo)用于转化子的筛选，其在培养基的工作质量浓度为50 μg/mL。培养温度为30 ℃，培养条件为200 r/min。

1.2.2 培养条件

从保藏于-80 ℃的甘油管里取0.1 mL菌液，接种至固体培养基，活化24 h后转接至YPD种子培养基，培养至对数生长中后期至OD值为8.0后，洗涤菌体并以体积分数为5%的接种量接种发酵培养基，发酵过程中分别在0、24、48、72、96、120 h测定生物量及相关代谢物的浓度。

1.3 酿酒酵母中的基因敲除方法

对酿酒酵母相关基因的敲除采用CRISPR-Cas9双质粒敲除方法。首先将pH-Cas9-Nours质粒转入酿酒酵母CICC31906中，硫酸诺尔斯菌素抗性平板筛选阳性转化子，得到CICC31906/pH-Cas9-Nours菌株。在网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)上设计出待敲除基因的靶序列，由上海生工生物公司合成相应引物(表2)后利用重叠PCR方法连接到质粒pYES2-Hyg上，构建相应基因的敲除质粒。利用醋酸锂转化法，将构建好的质粒pYES2-Hyg与敲除基因所对应的寡义核苷酸链(homo)共转化菌株CICC31906/pH-Cas9-Nours后，利用诺尔斯菌素与潮霉素的双抗平板筛选转化子。在30 ℃培养2 d后挑取单菌落进行菌落PCR，并测序验证。

表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 质粒的构建

1.4.1 单基因过表达质粒的构建

提取酿酒酵母染色体作为模板，分别通过引物对ARO8-BamH I-f/ARO8-SalI-r、ARO9-BamH I-f/ARO9-SalI-r和ARO10-BamH I-f/ARO10-MluI-r扩增出带有相应酶切位点的ARO8、ARO9和ARO10基因片段，双酶切后与同样黏性末端的质粒pYX212-zeo连接，得到质粒pYX-ARO8、pYX-ARO9和pYX-ARO10。

1.4.2 苯丙氨酸转氨酶与苯丙酮酸脱羧酶共表达质粒的构建

以质粒pYX-ARO10为模板，通过引物对TPI-BspT I-f/TT-BspT I-r扩增出带有BspT I酶切位点的PTPI-ARO10-TTT基因片段，BspT I单酶切后与带有同样黏性末端的质粒pYX-ARO8连接，构建得到双基因共表达质粒pYX-ARO8-ARO10。

1.5 分析方法

1.5.1 干重测定方法

发酵液中的菌体浓度以分光光度计测量600 nm处吸光值(OD600)表示。根据测定的酿酒酵母菌体干重(dry cell weight,DCW)(g/L)经验公式换算可得：DCW=OD600×0.301 2+0.001 6。

1.5.2 高效液相色谱测定方法

液相色谱样品前处理方法如下：取发酵液1 mL，常温12 000 r/min，离心2 min，取上清液沸水浴20 min后12 000 r/min离心20 min取上清液过滤，即可进行液相检测。

L-苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙酸和2-PE均使用HPLC C18色谱柱(ODS 5 μm，250 mm×4.6 mm，美国Waters公司)进行分离，紫外检测器在波长210 nm处检测，分离条件为：柱温40 ℃，流动相A液为水，B液为乙腈，B液体积分数为30%，流速为0.5 mL/min，苯乙酸、L-苯丙氨酸与2-PE的出峰时间分别为3.4、5.1和13.6 min。

甘油、乙酸、葡萄糖和乙醇均使用Aminex 251 HPX-87H色谱柱(ODS 9 μm，300 mm×7.8 mm，美国Bio-Rad公司)进行分离，示差检测器检测，分离条件为：柱温50 ℃，流动相为5 mmol/L稀硫酸，流速为0.8 mL/min，葡萄糖、甘油、乙酸与乙醇的出峰时间分别为9.6、12.9、14和17.9 min。

1.5.3 统计学分析方法

本研究所使用的统计学分析方法为t检验方法(单尾，双样本异方差分析)，使用SPSS 20.0(美国IBM公司)进行计算。

2 结果与分析

2.1 重组菌株的构建

本文通过实验室改良的CRISPR/Cas9方法(即pYES2-Hyg与pH-Cas9-Nours双质粒敲除方法，流程图2-A)，构建了基因敲除的酿酒酵母突变株RM22(pdc5△)、RM8(aro8△)和RM9(aro9△)。以PDC5基因的敲除为例，首先，以质粒pYES2-Hyg为模板，利用引物对471-f/gRNA-302-5-r和gRNA-149-9-f/471-r进行PCR扩增，得到片段Pro-Target和片段Target-Ter，大小分别为302、149 bp，后经过进一步的重叠PCR扩增，得到片段Pro-Target-Ter，大小为471 bp。利用BamH I和BcuI对其双酶切，与带有同样黏性末端的pYES2-Hyg质粒连接，构建质粒pYES2-PDC5-Hyg并转化E.coliJM109，用引物对605-f/605-r进行菌落PCR，得到大小为605 bp的条带(图2-B)，证明质粒pYES2-PDC5-Hyg构建成功。用同样的方法依次构建了质粒pYES2-ARO8-Hyg和pYES2-ARO9-Hyg，验证均正确。将质粒pYES2-PDC5-Hyg与寡义核苷酸链PDC5-homo一同转化到含有质粒pH-Cas9-Nours的酿酒酵母细胞中，涂布潮霉素和诺尔斯菌素双抗YEPD平板，用引物对PDC5-certi-f/PDC5-certi-r进行单菌落PCR验证，如图2-C所示。挑取单菌落进行摇瓶培养，提取酵母细胞染色体后测序验证正确，说明基因PDC5被成功敲除，构建得到突变株RM22。然后用同样的方法分别构建了突变株RM8和RM9，菌落PCR验证如图2-D所示。

本文中使用博来霉素抗性的带有强启动子TPI的质粒pYX212作为基因过表达质粒，相关质粒图谱与酶切验证如图2-E～图2-G所示。重组质粒pYX-ARO8经BamH I和SalI双酶切后得到的2条条带大小分别为1 513、8 902 bp，重组质粒pYX-ARO9经BamH I和SalI双酶切后得到的2条条带大小分别为1 552、8 902 bp，重组质粒pYX-ARO10经BamH I和MluI双酶切后得到的2条条带大小分别为1 943、8 906 bp，重组质粒pYX-ARO8-ARO10经BspT I单酶切后得到的2条条带大小分别为2 742、10 759 bp，核酸电泳验证以及测序均正确，证明重组质粒构建成功。

2.2 酿酒酵母产醇条件的确定

酿酒酵母在不同培养条件下合成2-PE的产量不同，因此，基于酿酒酵母发酵的常规特性、文献查阅和实验室条件摸索，首先确定了酿酒酵母的产醇条件。文献报道，以L-苯丙氨酸为唯一氮源的培养条件下，酵母主要通过艾氏途径合成2-PE。但芳香族氨基酸本身并不是易于酿酒酵母利用的高效氮源，如图3-A所示，培养基中只添加L-苯丙氨酸作为氮源时，酵母细胞生长缓慢，每24 h补糖(20 g/L)条件下发酵120 h，菌体干重最高仅为3 g/L；由于2-PE为生长偶联型产物，其合成也受到较大限制，仅为2.29 g/L。在发酵培养中发现，酵母粉的适量添加能够使酵母在发酵初期更多地积累菌体，有利于酵母细胞合成2-PE。如图3-B、图3-C所示，培养基中添加酵母粉4 g/L时，最利于酵母合成2-PE，其菌体干重达到7.2 g/L，2-PE的产量最高达到2.8 g/L。发酵至120 h，培养基中仍然残留3.76 g/LL-苯丙氨酸未被消耗。为了减少酿酒酵母发酵过程中乙醇、甘油等副产物的生成，采用初始葡萄糖质量浓度为20 g/L。由图3-D可知，每12 h补糖(20 g/L)与每24 h补糖(20 g/L)相比并不能显著提高酵母合成2-PE的产量(P>0.05)，葡萄糖可能被用于呼吸作用或合成其他副产物。

A-CRISPR/Cas9方法敲除基因流程图；B-质粒pYES2-PDC5-Hyg验证图(泳道M为DL 2 000 Marker，泳道1为片段Pro-Target，泳道2为片段Target-Ter，泳道3为片段Pro-Target-Ter，泳道4为转入质粒pYES2-PDC5-Hyg的突变菌株的菌落PCR验证)；C-菌株RM22中基因PDC5敲除验证图(泳道M为DL 5 000 Marker，泳道1为基因PDC5敲除前PCR验证，泳道2为基因PDC5敲除后PCR验证)；D-菌株RM9中基因ARO9敲除验证图(泳道M为DL 5 000 Marker，泳道1为基因ARO9敲除前PCR验证，泳道2为基因ARO9敲除后PCR验证)；E-重组质粒pYX-ARO8-ARO10谱图；F-过表达质粒的酶切验证图(泳道M为DL 15 000 Marker，泳道1为质粒pYX-ARO8的BamH I和Sal I双酶切验证图，泳道2为质粒pYX-ARO9的BamH I和Sal I双酶切验证图,泳道3为质粒pYX-ARO10的BamH I和Mlu I双酶切验证图)；G-重组质粒pYX-ARO8-ARO10的酶切验证图(泳道M为DL 15 000 Marker，泳道1为质粒pYX-ARO8-ARO10的BspT I单酶切验证图)图2 基因敲除突变株与重组质粒的构建Fig.2 The construction of gene-deleted mutant strains and plasmids

2.3 丙酮酸脱羧酶Pdc5p的缺失对酿酒酵母合成2-PE的影响

在酿酒酵母中，2-PE主要通过艾氏途径合成，其中苯丙酮酸脱羧酶催化苯丙酮酸生成苯乙醛，与其相关的基因包括PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3。然而，经过摇瓶发酵及产物测定，发现酿酒酵母PDC5基因的敲除对合成2-PE具有显著促进作用。如图4所示，在优化的培养基中，突变株RM22较对照株JM00而言，在细胞生长方面的变化不显著(P>0.05)，说明基因PDC5的缺失并未对酵母细胞的生长造成明显影响。突变株RM22的2-PE产量最高可达3.23 g/L，是对照菌株的1.12倍。这说明在酿酒酵母中敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC5，不但不能阻断苯丙酮酸合成苯乙醛，反而会加大支路途径末端产物2-PE的胞外积累。

基于基因PDC5的缺失对酿酒酵母的2-PE合成表现出促进作用，我们检测了pdc5△突变株中艾氏途径相关酶的转录水平变化，发现在含有不同浓度梯度的L-苯丙氨酸培养基中，艾氏途径关键酶的表达水平均有不同程度的变化(未发表内容)。

2.4 苯丙氨酸转氨酶Aro8p的表达对酿酒酵母合成2-PE的影响

在酿酒酵母中，催化L-苯丙氨酸与苯丙酮酸之间转氨作用的是可逆的Aro8p和Aro9p。考虑到目的产物合成的方向和倾向性，需要筛选出更偏好L-苯丙氨酸转氨合成苯丙酮酸方向的突变株，以促进2-PE的合成。首先探究了不同苯丙氨酸转氨酶对酿酒酵母合成2-PE的影响，我们构建了RM9 (WT-Aaro9△)、RM8 (WT-Aaro8△)、RM28(WT-A pYX-ARO8)、RM29(WT-A pYX-ARO9)、RM9-8(WT-Aaro9△ pYX-ARO8)和RM8-9(WT-Aaro8△ pYX-ARO9)，分析酿酒酵母苯丙氨酸转氨酶Aro8p和Aro9p的分别缺失与表达对酵母合成2-PE的影响。

A-菌株JM00以L-苯丙氨酸为唯一氮源的培养条件下发酵参数变化曲线；B-培养基中酵母粉添加量分别为2、4、10、20 g/L时菌株JM00的细胞干重增长与葡萄糖消耗曲线；C-培养基中酵母粉添加量分别为2、4、10、20 g/L时菌株JM00的L-苯丙氨酸消耗与2-PE合成变化曲线；D-菌株JM00培养过程中每12 h添加葡萄糖(20 g/L)的各发酵参数变化曲线图3 酿酒酵母合成2-PE条件的确定Fig.3 Fermentation condition of the synthesis of 2-phenylethanol in S.cerevisiae

A-菌株JM00的发酵参数变化曲线；B-菌株RM22的发酵参数变化曲线图4 菌株 RM22的发酵结果Fig.4 Fermentation performance of strain RM22

由图5-A可知，菌株RM8与RM9发酵过程中最大细胞干重均仅为0.6 g/L，说明苯丙氨酸转氨酶I和II的缺失均会严重阻碍酿酒酵母CICC 31906的细胞生长；而菌株RM28与RM29生长状况良好，细胞干重与出发菌株JM00相比没有显著差异。在产物2-PE的合成方面(图5-B)，菌株RM8与RM9的发酵液上清液中未检测到2-PE，菌株RM28和菌株RM29发酵120 h时合成2-PE质量浓度分别为2.97和2.32 g/L。菌株RM9-8和RM8-9的发酵结果如图5-C和图5-D所示，发酵96 h后干重分别达到6和3.5 g/L，较对照菌株JM00明显下降；发酵96 h时菌株RM9-8能够合成2-PE 3.13 g/L，比JM00增加了0.25 g/L；而菌株RM8-9最高仅能合成1 g/L 2-PE。考虑到生长情况的差异，菌株JM00、RM9-8、RM8-9合成2-PE的浓度分别为0.37、0.53和0.28 g/g DCW。相应地，发酵过程中3株菌对培养基中L-苯丙氨酸的消耗情况也有差异，如图5-D所示。由上述结果可知，基因ARO8编码的苯丙氨酸转氨酶I在2-PE的合成代谢中发挥重要作用。

A-菌株RM8、RM9、RM28和RM29的细胞生长和葡萄糖消耗曲线；B-菌株RM8、RM9、RM28和RM29的2-PE合成与L-苯丙氨酸消耗曲线；C-菌株JM00、RM9-8和RM8-9的细胞生长和葡萄糖消耗曲线；D-菌株JM00、RM9-8和RM8-9的2-PE合成与L-苯丙氨酸消耗曲线图5 不同苯丙氨酸转氨酶对酿酒酵母产2-PE的影响Fig.5 Influence on 2-phenylethanol production by different phenylalanine transaminase-expressing in S.cerevisiae

2.5 酿酒酵母高产2-PE平台菌株JM59-810的建立与策略分析

为了进一步促进酿酒酵母合成2-PE，在重组菌中过量表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10p，构建了重组菌JM59-810(pdc5△aro9△PTPI-ARO8-TTTPTPI-ARO10-TTT)，并进行摇瓶发酵，出发菌株JM00和重组菌JM59-810的发酵情况如图6所示。经过120 h摇瓶发酵，菌株JM00和JM59-810的菌体干重分别达到7.8和7.65 g/L，差异不显著(P>0.05)，说明重组菌JM59-810的生长状况良好，上述代谢改造手段未对酵母的生长产生明显负担。重组菌JM59-810的发酵副产物甘油最高产量为4.40 g/L，与菌株JM00相比提高了0.66倍；而乙酸最高产量为0.72 g/L，是菌株JM00的0.67倍。这是由于酵母突变株中丙酮酸脱羧酶Pdc5p的缺失削弱了下游产物乙酸的合成，同时促进了竞争途径中甘油的合成。菌株JM00和JM59-810的乙醇产量最高为3.31和3.24 g/L，没有显著差异(P>0.05)。如图6-B和图6-D所示，重组菌的2-PE最高产量为3.85 g/L，是出发菌株JM00(2.88 g/L)的1.33倍，说明敲除PDC5和ARO9并过表达ARO8和ARO10的改造策略能够有效提高酵母细胞合成2-PE的能力。

A-出发菌株JM00的葡萄糖消耗和乙醇、乙酸、甘油生成曲线；B-出发菌株JM00的细胞生长、2-PE、苯乙酸、苯丙酮酸合成与L-苯丙氨酸消耗曲线；C-重组菌JM59-810的葡萄糖消耗和乙醇、乙酸、甘油生成曲线；D-重组菌JM59-810的细胞生长、2-PE、苯乙酸、苯丙酮酸合成与L-苯丙氨酸消耗曲线图6 出发菌株JM00和重组菌JM59-810的发酵情况Fig.6 Fermentation performance of strain JM00 and the metabolic strain JM59-810

3 结论与讨论

利用酿酒酵母的艾氏途径合成2-PE已得到广泛的研究，包括提高酶活性与表达水平[6,19]、启动子替换[11,20]及产物原位分离[21-22]等代谢改造策略均能有效提高2-PE的产量。酿酒酵母的艾氏途径中，苯丙酮酸脱羧形成苯乙醛的反应主要由苯丙酮酸脱羧酶Aro10p催化，丙酮酸脱羧酶Pdc1、Pdc5、Pdc6因其较为广泛的底物谱，也能够对此反应起到一定的催化作用[17,23]。有研究指出，敲除基因PDC1能够激活PDC5的转录水平，表现出对PDC1缺失的代偿作用[14, 24]；基因THI3也在酶反应的过程中发挥着重要的调节作用[16]。因此，PDC5表现出苯丙酮酸脱羧酶催化活性的同时，同样可能具备调控功能，并且可能以多种方式在2-PE的合成中发挥积极作用。酿酒酵母CICC31906的PDC5△突变株中艾氏途径相关酶的表达水平不同程度地提高，尤其是编码芳香族氨基酸转氨酶基因ARO8转录水平稳定上调，导致其合成2-PE的能力显著提高，这在以往的研究中未见报道。有别于直接过量表达合成途径中相关酶的策略，本文提供了一种利用酿酒酵母合成2-PE的新思路，即通过敲除酵母PDC5基因的间接调控作用，实现相关酶的过表达，以促进2-PE合成。然而，目前关于PDC5的研究还停留在酶活性、转录水平的方面，可供参考的晶体结构、作用机制和调控功能等研究还有待深入发掘。