结肠直肠癌病人D-二聚体升高的研究

茅届齐， 徐多刚， 张米粒， 肖蕴誉， 明 旭， 李雨哲， 曹 灿， 于 亮， 李继坤

（南京医科大学附属上海一院临床医学院a.血管外科，b.胃肠外科，c.麻醉科，上海201620）

静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE) 在结肠直肠癌(colorectal cancer,CRC)病人的发生率达 6.6%［1］，而在转移性 CRC中，VTE的发生率高达 23.3%［2-3］。 早在 1865 年，法国医师 Trousseau 描述了胃癌病人患血栓的现象［4］。恶性肿瘤病人发生VTE的风险比正常人增加4～7倍。

Dai等［5］报道 290 例 CRC 病人术前 D-二聚体的均值明显高于正常人群，转移性CRC病人的D-二聚体值又高于未转移病人。Lin等［6］荟萃分析37项临床研究，包括12 359例肿瘤病人，发现在所有涉及的肿瘤中，结肠癌和直肠癌病人的D-二聚体升高与总生存期缩短的相关性最高(HR=2.32,95%CI：1.89～2.85)。但这两项研究仅描述肿瘤病人D-二聚体的现象，未讨论不同分型的肿瘤对凝血系统作用的差异，对与D-二聚体升高相关的临床和病理因素也未作进一步分析。为排除手术、放疗、化疗、深静脉置管等掺杂因素对血栓的干扰，更准确研究肿瘤细胞对凝血-纤溶系统的作用，笔者选择可切除的CRC病例为研究对象，采集术前血标本进行分析，排除治疗措施对研究结果的干扰。以D-二聚体为凝血状态的判断工具，进行分层设计，以期获得比VTE分层更敏感和特异的结果。

资料与方法

一、临床资料

纳入2018年8月至2019年12月在我院胃肠外科诊断为CRC并手术治疗的病人。病人发病前1年无VTE或动脉血栓疾病史，无其他恶性肿瘤病史，无再次手术。病史资料完整。

二、数据获取

利用海泰电子病例系统查阅相关临床资料，获得术前D-二聚体值及围术期的下肢静脉Doppler超声检查报告、术后病理检查报告(病理分型、TNM分期、脉管内肿瘤侵犯)。

三、VTE和D-二聚体定义

VTE的定义：Doppler超声检查证实的下肢深静脉血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)或肺动脉CTA检查证实的肺动脉栓塞 (pulmonary embolism,PE)。D-二聚体升高的定义：血清D-二聚体＞550 μg/L 为升高，＞1 650 μg/L 为显著升高。

四、统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行分析。病例指标以均数±标准差表示。根据病理分型、TNM分期、有无脉管内肿瘤侵犯、有无发生VTE以及血液指标是否处于正常值水平，对病例进行分层或占比计算。连续数据使用t检验，率的比较用卡方统计。多因素比较用Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

结 果

本研究共249例，平均年龄(62.4±11.2)(29～84岁)，其中男137例，女112例。结肠癌143例(远处转移13例)，直肠癌106例(远处转移3例)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人分别 46、74、113、16 例。高分化腺癌40例，中分化腺癌161例，低分化腺癌25例，其他类型23例。黏液性肿瘤27例，非黏液性肿瘤222例。病理检查证实脉管内肿瘤侵犯106例，无脉管内肿瘤侵犯143例。明确远处转移15例，无转移234例。全部病人术前D-二聚体(698±814)μg/L，其中正常145例(58.2%)，高于正常104例(41.8%)，明显高于正常27例(10.8%)。肿瘤体积中位数为6.53 cm3；Ki67中位数为55%。住院期间确诊发生VTE 7例，均发生于术后。其中下肢DVT发生6例(左侧5例，右侧1例)，为Doppler超声检查证实；肺栓塞发生1例。该7例VTE病人经抗凝等处理后均恢复良好。分析病人各临床及病理检查参数与D-二聚体升高的相关性，远处转移(RR=0.581，95%Cl：0.403～0.837，P<0.01)、 脉管内肿瘤侵犯 (RR=0.660，95%Cl：0.493～0.884，P<0.05)是高凝状态(D-二聚体＞550 μg/L)的独立影响因素。性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、低分化腺癌、黏液性肿瘤、肿瘤体积、Ki67等与D-二聚体升高的相关性见图1。

图1 D-二聚体高于正常值相关因素的RR

本研究多因素分析中与高凝状态及VTE发生有关的各因素具体结果分析如下。

一、远处转移与高凝状态

按是否远处转移进行亚组分析术前的D-二聚体水平，有远处转移病人的D-二聚体值(1 651±1 991 μg/L)显著高于无转移病人(637±636 μg/L)。在明确远处转移病人中，术前D-二聚体升高病例占比(73.3%)显著高于无远处转移者(37.6%)(见表1)。

表1 远处转移与D-二聚体[n（%）]

二、脉管内肿瘤侵犯与VTE及高凝状态

脉管内肿瘤侵犯的病例D-二聚体均值(897±1 082 μg/L)高于无侵犯者(550±489 μg/L)，且 D-二聚体超过正常值的病人比例(55/106，51.9%)明显高于无侵犯者(49/143，34.3%)(见表2)。

表2 脉管内肿瘤侵犯与D-二聚体[n（%）]

三、脉管内瘤栓侵犯及转移的比例随D-二聚体水平变化情况

249例病人按D-二聚体数值，分为正常组(145例)、升高组(77例)和显著升高组(高于正常上限 3 倍，即＞1 650 μg/L，27 例)，可见随 D-二聚体水平的升高，脉管内肿瘤侵犯的比例上升，转移比例也呈相似上升趋势，各组间差异有统计学意义(见图 2)。

图2 D-二聚体水平与脉管内肿瘤侵犯及远处转移的关系

四、肿瘤部位与高凝状态的关系

本研究结肠癌病人术前D-二聚体的均数(820±987 μg/L)高于直肠癌病人(532±445 μg/L)；结肠癌病人术前D-二聚体升高的比例 (48.2%)高于直肠癌病人(33.0%)(见表3)。

表3 肿瘤部位与D-二聚体[n（%）]

五、术前D-二聚体与VTE发生的相关性

本研究249例病人中，术前D-二聚体正常水平145例(58.2%)，高于正常且低于正常上限3倍的有77例 (30.1%)，其中升高3倍以上27例(10.8%)。3组VTE的发生率逐渐升高，显示两者变化的同向性(见图3)。

图3 VTE发生率与术前D-二聚体水平变化趋势

讨 论

恶性肿瘤病人一旦出现血栓，生存时间明显短于未形成血栓者。肿瘤相关血栓(cancer associated thrombosis,CAT)加重癌症病情，恶化生存率和预后［7］，是癌症病人排名第 2 的死亡原因［8］。

不同肿瘤VTE发生率存在较大差异，这从很大程度上归因于其对凝血系统的影响，多数肿瘤可以不同程度地引起血液高凝状态。本质上，血液高凝状态是VTE发生的基础，可认为VTE是血液高凝状态基础上发生的极端性事件。

有证据表明，恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移与VTE的风险之间存在一定的变化规律。癌细胞或其产物，诸如细胞外囊泡、可溶性分子等，与宿主凝血系统相关细胞的接触概率升高、相互作用增强，导致血液高凝状态，使得VTE发生的风险增加［9］。

肿瘤相关性血栓是临床经常遇到的问题。肿瘤本身导致的高凝状态是隐藏在血栓性事件背后的基础。本研究249例平均术前D-二聚体值达697 μg/L，较正常范围上限(550 μg/L)高近 30%。其中104例术前D-二聚体值高于正常范围，占病例数的41.8%。27例D-二聚体值高于正常范围的3 倍，即＞1 650 μg/L。 7 例(2.8%)在住院期间发生VTE。与既往报道相比，本研究VTE发生率较低。笔者认为这与观察时段有关。已有研究将VTE事件定为诊断明确CRC前的6个月至死亡［10-11］，时间跨度很大。本研究仅采集围术期的VTE事件，故得到较低的发生率。鉴于本研究目的主要是研究肿瘤本身对高凝状态的影响，而长周期随访虽不易遗漏VTE的发生，但无法排除治疗措施等干扰，如化疗、放疗、免疫治疗、静脉导管植入等，所以笔者选取可切除CRC病例的术前D-二聚体值作为高凝状态的评价指标。

D-二聚体是交联纤维蛋白降解后的产物，而交联纤维蛋白正是血栓的主要结构。D-二聚体升高说明体内存在活动性血栓形成过程，且有很高的灵敏度和特异度。因此，D-二聚体被认为是评估体内高凝状态的有效指标［12］。手术可导致凝血-纤溶系统的活化，造成术后D-二聚体升高，且其变化程度受非单一因素影响，会导致混杂无法排除。因此，笔者采用术前D-二聚体数值进行分析。由于排除手术本身的影响，因此认为该指标的升高与CRC有关。部分CRC病人术前的D-二聚体升高，证实在这些病人体内存在不同程度的高凝状态。根据D-二聚体水平，把病例分成D-二聚体正常组、D-二聚体升高组和D-二聚体显著升高组。各组的VTE发生率呈现显著升高趋势，说明D-二聚体与VTE发生的同向性，且具有更高灵敏度。

本研究D-二聚体数值分布区间较大，且近60%病人D-二聚体并无明显升高。为探究具体各肿瘤特征因素与高凝状态的关系，根据肿瘤分化程度、类型、TNM分期、远处转移与否、脉管内肿瘤侵犯与否和D-二聚体升高程度，进行亚组间分析比较。各亚组的数据显示，高凝状态的发生与远处转移和脉管内肿瘤侵犯存在相关性，而与性别、年龄、肿瘤类型、分化程度、分期等相关分析无统计学意义。数据显示，结肠癌病人高凝状态的发生率高于直肠癌病人。进一步分析两组病人，发现143例结肠癌病例中13例(9.0%)远处转移，而106例直肠癌病例中远处转移仅3例 (2.8%)。基于转移病人D-二聚体高于非转移病人的事实，推测结肠癌组中因包含更多远处转移病人，显示上述差异。将两组中有脉管内肿瘤侵犯和转移的病例去除后再次比较，发现结肠癌与直肠癌组术前的D-二聚体数值分别为(556±480)μg/L 和(543±417) μg/L，两者几乎在同一水平上。由此认为D-二聚体水平在结肠癌与直肠癌病人中的差异可能是两组病例中远处转移和脉管内肿瘤侵犯比例不同造成。

肿瘤相关性血栓或肿瘤导致的高凝状态作为一个历久弥新的话题，一直受到研究者的关注，尤其近年在机制研究方面已有进展。现在可明确的是肿瘤细胞主要通过3个方面影响凝血系统。首先，癌细胞通过在其细胞膜表面表达多种促凝血物质，激活凝血系统。在这些肿瘤表面促凝物质中最重要的就是组织因子(tissue factor，TF)。作为外源性凝血途径的起始因子，TF可直接启动凝血级联反应，导致血栓形成。肿瘤细胞之所以高表达TF，与某些癌基因的突变或抑癌基因的失活有关［13］。其次，癌细胞可释放细胞外囊泡(extra-cellular vesicle，EV)。这些囊泡表达癌细胞的典型表面蛋白质，并可通过融合过程而携带从其他细胞获得的蛋白质［14］。其中，荷载TF的EV最受关注，而EV表面大量表达的磷脂分子阴极端又可活化TF，使其发挥更大效能［15］。Davila等［16］分离肿瘤病人血浆中荷载TF的EV，从静脉注入小鼠体内，可诱发TF途径依赖的凝血系统活化，并导致弥散性血管内凝血。最后，肿瘤细胞或肿瘤源性EV可与宿主的血小板、白细胞和内皮细胞等相互作用。肿瘤细胞刺激血小板，使后者暴露磷脂酰丝氨酸分子的阴极端，从而激活凝血系统。值得注意的是，在这个过程中，血小板可大量聚集并附着在肿瘤细胞表面，在肿瘤细胞表面形成“外衣”。这种结构可降低宿主免疫系统对肿瘤细胞的识别度，与肿瘤的转移有一定关系［9］。

上述肿瘤细胞影响凝血系统的3个方面途径，发现无论哪个途径，其基础都是肿瘤细胞或其产物与凝血因子、血小板和内皮细胞的直接接触。换言之，只有肿瘤细胞进入血管，其对凝血系统的影响才有可能。本研究106例(44.2%)病理检查证实有脉管内肿瘤侵犯，这部分病人的D-二聚体均值是 (897±1 082)μg/L，较无脉管内肿瘤侵犯组的(550±489)μg/L明显升高，差异有统计学意义。侵入血管的肿瘤细胞通过前述3个机制，激活凝血系统，而纤维蛋白的产生又激活纤溶系统，导致D-二聚体升高。同时，发现远处转移的病例术前D-二聚体呈现更高的状态，有远处转移组和无远处转移组的 D-二聚体值分别为 1 651 μg/L和 637 μg/L(P<0.01)。笔者认为脉管内肿瘤侵犯和远处转移的病人共性是，肿瘤细胞侵入血管，与凝血因子、血小板和凝血因子接触。肿瘤细胞以及肿瘤源性EV表面的TF启动外源性凝血途径，激活凝血系统，导致可溶性纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，并活化血小板。同时继发性激活纤溶系统，导致D-二聚体升高。本研究D-二聚体随脉管内肿瘤侵犯和远处转移的变化趋势非常相似，只是后者的D-二聚体绝对数值高于前者。由此推测，从肿瘤细胞对凝血-纤溶系统的影响来说，远处转移和脉管内肿瘤侵犯的基本原理一致，区别只是进入血液的肿瘤细胞数量不同以及是否随血流到达其他部位定植，故产生作用的强度有差别。本研究中，则表现为高凝状态(即D-二聚体升高)的程度不同，仅1例(0.7%)VTE发生于无脉管内肿瘤侵犯的病人；有脉管内肿瘤侵犯的病人VTE 发生率为 5.7%(P<0.01)(见表 2)。 Ades等［2］研究发现，Kras基因突变型的结肠癌病人比Kras野生型病人更易发生VTE，而Kras基因突变又与肿瘤侵袭性有关。所以，不排除Kras或其他癌基因的突变导致肿瘤细胞更易侵入血管，从而激活凝血系统而诱发VTE。肿瘤侵袭性与肿瘤相关性血栓间是否存在因果关系；如这种关系存在，是否存在癌基因或抑癌基因突变调控上述过程，还有待进一步研究证实。

笔者认为，肿瘤细胞进入脉管内可能同时增加远处转移和高凝状态的风险，所以在肿瘤播散(尤其是血行播散)和高凝状态之间存在一定的平行关系。本研究通过多因素回归分析证明脉管内肿瘤侵犯与高凝状态的关系，提示血液高凝状态(如D-二聚体升高)，可能成为术前预测肿瘤远处转移的指标。同时，脉管内肿瘤侵犯也可能成为预测病人血栓性事件的风险指标，为更精准的抗凝治疗方案提供依据。