响应面法优化滇黄精多酚的提取工艺及抗氧化活性

杨勇帮，胡栋宝，普晓燕，杨 猛

(1.玉溪市食品药品检验所，玉溪 653100；2.玉溪师范学院化学生物与环境学院，玉溪 653100)

滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)属百合科植物，有节节高、德保黄精和仙人饭等多个名称，主产于中国云、贵、川等地[1]。滇黄精药用部位为干燥根茎，性平、味甘，兼具抗病毒、止血、抗疲劳、降血糖、抗氧化、滋阴补气及健脾润肺等功能，可预防心血管疾病、脾胃虚弱、体虚无力、口干舌燥、肺虚燥咳、精血无余等症[2]。滇黄精的主要化学成分有生物碱、木质素、蒽醌、甾体皂苷、三萜、黄酮、多酚、多糖及挥发油等活性物质[3-4]。目前，关于滇黄精中多糖和黄酮类物质的研究较多，但对其多酚类物质的研究鲜有报道。多酚类物质抗氧化活性较强，能很好地清除自由基，延缓衰老[5]，为了更好地开发利用滇黄精的食用、药用价值，本研究应用单因素实验与响应面法[6-9]，以滇黄精多酚提取量为参考标准，采用Box-Behnken实验设计优化提取工艺，研究滇黄精多酚的抗氧化活性，为药食同源资源的开发利用提供理论依据。

1 仪器和试药

1.1仪器 SHZ-D(Ⅲ)型水循环真空泵(巩义市子华仪器设备有限责任公司)；H2-16K型台式高速微量离心机(河南可成仪器设备责任有限公司)；CAV114C型电子分析天平(奥豪斯电子仪器有限公司)；紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器责任有限公司)；EYELA型水浴锅(上海爱朗仪器有限分公司)；SY3200-T型超声波清洗设备(上海声源超声波仪器技术设备管理有限公司)。

1.2试药 滇黄精药材，采自云南省玉溪市新平县哀牢山，经玉溪市食品药品检验所牟娟副主任中药师鉴定为百合科植物滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)的根茎。没食子酸(分析纯)，武汉远成共创科技有限公司；甲醇、丙酮(分析纯)，四川西陇化工技术有限公司；抗坏血酸(分析纯),天津市双船化学试剂厂；福林酚、碳酸钠(分析纯),均购自国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(分析纯),均购自艾科达成都化学试剂有限公司；磷酸氢二钠(分析纯),天津市风船化学试剂科技发展有限公司；三氯乙酸(分析纯),天津市大茂化学试剂厂；福林酚试剂(分析纯)，南京都莱生物技术有限公司；铁氰化钾(分析纯)，四川西陇化工技术有限公司。

2 方法

2.1滇黄精多酚的提取 精密称定0.5 g滇黄精粉末，置于锥形瓶中，精密加入10 mL不同体积分数的乙醇，混匀后置于功率为220 W的超声仪中超声提取1 h，抽滤，收集滤液，滤渣中加入一定量的乙醇再重复抽滤2次，合并滤液，置于25 mL比色管中，加不同体积分数的乙醇稀释至刻度，即得滇黄精多酚提取液。在10 mL试管中加入滇黄精多酚提取液1 mL及福林酚试剂0.5 mL，振荡并摇匀，静止放置反应5～7 min，再加入150 g·L-1的碳酸钠溶液1.5 mL，混匀，冷却至室温，避光静置1 h，用超纯水作空白对照实验，在400～900 nm波长范围内测定吸光度值，测得滇黄精多酚的最大吸收波长为740 nm。

2.2绘制没食子酸的标准曲线 精密称定没食子酸对照品适量，置于50 mL量瓶中，加体积分数为40%的乙醇40 mL溶解并稀释至刻度，得0.2 mg·mL-1的没食子酸对照品储备液。精密量取没食子酸对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于25 mL比色管中，按顺序分别加入福林酚试剂0.5 mL，振荡摇匀并静置反应5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸钠溶液1.5 mL并稀释至10 mL刻度，冷却至室温，避光静置反应1 h，在740 nm波长处测定吸光度值A。以没食子酸溶液的质量浓度为横坐标(x)、吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得线性回归方程为y=78.314x+0.043 3(R2=0.996 7)。

2.3滇黄精多酚的测定 取1.2.1项下制备的滇黄精多酚提取液1 mL和福林酚试剂0.5 mL，振荡并摇匀，静止放置反应5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸钠溶液1.5 mL，混匀，冷却至室温，避光静置1 h，用超纯水作空白对照，吸收波长为740 nm。测定吸光度值A，计算滇黄精多酚的质量浓度。各实验组平行取样3份进行测定，取其平均吸光度值代入没食子酸线性回归方程计算滇黄精多酚质量浓度，根据公式计算滇黄精多酚的提取量：G=(T×V2×V1) ÷(m×V)，式中：G为滇黄精多酚的提取量(mg·g-1)；T为滇黄精多酚质量浓度(mg·mL-1)；V1为首次稀释后体积(mL)；V2为二次稀释后体积(mL)，定容至10 mL；V为移取的样品体积(mL)；m为滇黄精取样粉末质量(g)。

2.4单因素实验提取滇黄精多酚 考察乙醇体积分数(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1)、超声时间(30、40、50、60、70、80 min)以及不同提取溶剂(蒸馏水、体积分数为40%的甲醇、体积分数为40%的乙醇、体积分数为40%的丙酮)4个因素对滇黄精多酚提取量的影响，综合分析确定其最佳提取条件。各因素分别设置3个因素，每组进行3次平行实验，取平均值。

2.5响应曲面法优化总多酚实验 参照Box-Behnken设计中心组合实验，响应曲面的优化影响因素分别为乙醇体积分数 (A)、超声时间 (B)和液料比(C)，以滇黄精多酚提取量作为响应值设计实验，见表1。

表1 Box-Behnken设计的因素与水平

2.6抗氧化实验 按照响应面优化的最佳条件(乙醇体积分数为38.7%、超声时间为58 min、液料比为55∶1)，按照1.2.1项下方法提取滇黄精多酚提取液，调整波长至740 nm处，测定吸光度值，通过线性回归方程计算得滇黄精多酚的质量浓度为0.008 mg·mL-1，设置不同的质量浓度梯度，分别用DPPH、ABTS、三价铁离子作为抗氧化试剂，对滇黄精多酚提取液的还原能力进行测定，以抗坏血酸作为阳性对照。

2.6.1DPPH自由基清除活性的测定 准确称量4.0 mg的DPPH，置于100 mL量瓶中，加乙醇得浓度为0.1 mmol·L-1的DDPH溶液，移取1 mL不同质量浓度梯度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黄精多酚提取液，置于比色管中，加入DPPH溶液2 mL，室温静置30 min，于517 nm波长处测定其吸光度值(Ax)，然后用1 mL吸量管准确移取1 mL不同质量浓度的滇黄精多酚提取液置于试管中，用2 mL乙醇替代自变量DPPH，静置30 min后测定其吸光度值(Ay)；准确移取2 mL乙醇置于干燥的试管中，按顺序加入2 mL DPPH溶液，放置30 min后，测定吸光度值(A0)，用抗坏血酸作为阳性对照，计算 DPPH清除率，DPPH清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.2ABTS自由基清除能力的测定 准确称量0.038 4 g ABTS固体和0.013 4 g过硫酸钾固体，分别置于10 mL量瓶中，加超纯水定容至刻度，取上述溶液和过硫酸钾按照1∶1的比例混合，摇匀，冷却至室温，避光放置16 h，制成ABTS工作液，备用。取5 mL ABTS工作液，加无水乙醇，调整波长至734 nm处测定吸光度值A；取1 mL不同质量浓度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黄精多酚提取液置于比色管中，分别加入ABTS溶液4 mL，避光静置10 min，调整波长至517 nm处，测定吸光度值(Ax),移取1 mL不同质量浓度的提取液置于比色管中，加入无水乙醇4 mL代替自变量ABTS，室温避光静置10 min，于517 nm波长处测定吸光度值(Ay)，移取无水乙醇4 mL置于比色管中，依次加入ABTS溶液4 mL，放置10 min测其吸光度值 (A0)，用抗坏血酸作为阳性对照，ABTS清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.3三价铁还原能力的测定 取1 mL不同质量浓度的滇黄精多酚提取液，加入2.5 mL PBS(0.2 mol·L-1，pH值为6.6)和10 g·L-1铁氰化钾溶液，混匀，于50 ℃恒温水浴锅中反应20 min，再加入2.5 mL超纯水和0.5 mL三氯乙酸(体积分数为10%)终止反应，以5 000 r·min-1离心30 min，取上清液静置10 min，在700 nm波长处测定其吸光度值A，用抗坏血酸作为阳性对照。

3 结果与分析

3.1单因素实验结果

3.1.1乙醇体积分数对滇黄精多酚提取量的影响 滇黄精多酚提取量随乙醇体积分数的逐渐增加呈现先增后减的趋势，原因可能与乙醇的极性有关，体积分数不相同，极性也不相同，当乙醇体积分数为40%时，其极性和滇黄精多酚极性最接近，溶解性最好，使其大量溢出[9]；体积分数较低的乙醇可进入植物细胞内部并溶解液泡中的水溶性酚类，当乙醇体积分数过高时则会引起蛋白质变性，阻碍滇黄精多酚的提取[10]。另外，脂溶性杂质成分与乙醇-水分子结合能力与乙醇体积分数成正比，形成了竞争性抑制剂，从而导致滇黄精多酚提取量的降低，所以乙醇体积分数过低或过高都不利于滇黄精多酚的断裂和扩散[11]。

3.1.2液料比对滇黄精多酚提取量的影响 滇黄精多酚提取量与液料比的变化规律：液料比为60∶1时，滇黄精多酚的提取效果最佳，随后下降，液料比过高或过低都会使其他物质(如多糖)溶出而影响滇黄精多酚析出[9-10]。其次，滇黄精多酚的量是一定的，到达一定程度就无法析出，所以即使增多溶剂量也无法增多滇黄精多酚的提取量,因此60∶1是提取滇黄精多酚的最佳液料比。

3.1.3超声时间对滇黄精多酚提取量的影响 超声时间为60 min时提取效果最佳，原因是超声时间过短，滇黄精多酚类物质未完全与组织分离；而超声时间过长会产生机械力和热能降解，从而使滇黄精多酚类物质遭到破坏，降低提取量[10-13]。因此超声时间为60 min时，滇黄精多酚的提取量最大，为1.125 mg·g-1。

3.1.4不同溶剂对滇黄精多酚提取量的影响 考察不同溶剂对滇黄精多酚提取量的影响，结果为：蒸馏水<体积分数为40%的甲醇<体积分数为40%的乙醇<体积分数为40%的丙酮，这可能是由于滇黄精多酚在蒸馏水和体积分数为40%的甲醇中溶解不充分，可以使滇黄精多酚的氢键和疏水键与组织内物质断裂而充分溶出，因此体积分数为40%的丙酮提取量更高[13]。

3.2Box-Behnken优化提取工艺

3.2.1使用Box-Behnken优化实验设计方案 见表2和表3。由表2可知，滇黄精多酚提取量的回归方程为Y=0.86-0.028A+0.051B+0.083C+0.019AB-0.026AC+0.053BC-0.03A2+0.013B2-0.026C2,相关系数R2=0.991 5，对线性回归方程分析可知，拟合状况较好，结果可靠。由表3可知，模型的F=90.50，P<0.000 1，该模型显著性差异小且数据拟合度高。实验模型的R2=0.991 5表明实验结果与预测性一致性良好，表明该回归模型拟合性好、回归方程代表性良好，能准确预测实际情况。Radj2=0.980 5表明实验结果为0.980 5时受实验因素影响，模型能解释98.05%响应值变化。变异系数(CV)=0.86%表明实验随机误差小，失拟值P=0.014<0.005表明该方程具有较好的拟合性，方法可取，滇黄精多酚提取量的测定可用该方法进行预测。分析可知，滇黄精多酚提取量受3个因素影响的顺序依次为：液料比(C)>超声时间(B)>体积分数(A)。

表2 滇黄精多酚提取工艺响应面设计及其结果

表3 线性模型的方差分析

3.2.2响应面分析 在响应面图中，曲面形状反映出响应曲面点的交互作用对滇黄精多酚提取量的影响，曲面坡度倾斜度越大，影响越大，曲面坡度倾斜度越小，影响越小[9-12]。见图1。由图1可知，液料比对滇黄精多酚提取量的影响大于超声时间，超声时间对滇黄精多酚提取量的影响大于乙醇体积分数，曲面坡度倾斜度最大，对多酚提取量的影响呈高度显著。采用Box-Behnken优化提取工艺，得最佳提取工艺为：乙醇体积分数为38.7%，液料比为55∶1，超声时间为58 min。

图1 响应面分析图

3.3抗氧化活性 见表4。由表4可知，不同质量浓度滇黄精多酚提取液和维生素C溶液对DPPH、ABTS自由基的清除能力、三价铁的还原能力有如下规律：当两者质量浓度为0.002 mg·mL-1时，维生素C溶液对DPPH自由基的清除能力以及三价铁的还原能力强于滇黄精多酚提取液；当两者质量浓度为0.004 mg·mL-1时，对于DPPH自由基的清除能力以及三价铁的还原能力，滇黄精多酚提取液和维生素C溶液两者能力接近；而当两者质量浓度大于0.006 mg·mL-1时，滇黄精多酚提取液对DPPH自由基的清除能力以及三价铁的还原能力均强于维生素C溶液，最佳清除率达到89%。滇黄精多酚提取液和维生素C溶液对ABTS自由基的清除能力也随两者的质量浓度变化呈正比，对ABTS自由基的清除能力表现为：滇黄精多酚提取液在不同质量浓度下清除能力均强于维生素C溶液，特别是在质量浓度大于0.006 mg·mL-1时，两者对自由基清除能力相差较大，滇黄精多酚提取液对自由基的最佳清除率能达到88%。

表4 滇黄精多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及三价铁的还原能力

4 结论

采用超声波辅助技术提取滇黄精多酚，探究4个单因素实验对其提取量的影响，确定最佳提取条件；再采用响应面法优化提取工艺得到滇黄精多酚的最佳提取工艺为：乙醇体积分数为38.7%，液料比为55∶1，超声时间为58 min。抗氧化活性结果表明，除在0.002和0.004 mg·mL-1质量浓度时，滇黄精多酚提取液的DPPH自由基清除率略小于维生素C溶液或与维生素C溶液接近；其余的相同质量浓度水平，滇黄精多酚提取液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及三价铁还原能力均高于维生素C溶液，可为天然抗氧化剂的开发提供参考。