HPLC-PDA法同时测定羽裂蟹甲草花中3种香豆素的含量

高 昕，杨怡璇，张晓娜，刘 霞*

(1.西安交通大学药学院，西安 710061； 2.甘肃百草中药材种植有限公司，兰州 730102)

菊科(Compositae)蟹甲草属(CacaliaLinn.)植物约有80种，分布于亚洲东北部和美洲，我国有60余种，主产地为西北地区和西南地区[1]。我国民间共有26种该属植物被用作传统中药[2]，其具有清热解毒、祛风除湿、消炎止咳及消肿止痛等功效，主治风湿关节痛、肺结核、支气管炎、跌打损伤、血崩、咳血、痢疾和水肿等症[3]。由于蟹甲草属植物具有很好的药用价值，因此对该属植物中活性成分的研究及开发利用具有重要意义。作者对采自甘肃尖山的羽裂蟹甲草[Cacaliatangutica(Franch.) Hand.-Mazz.]的花进行了化学成分研究，从中分离得到了7-羟基香豆素(HC)、7-羟基-8-甲氧基香豆素(HMC)和7β-D-葡萄糖-8-羟基香豆素(GC)共3种香豆素类化合物。文献报道[4-7]，香豆素类化合物具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抗高血压、抗癌等多种药理作用。为了更全面了解该植物的特性，有必要对其中的3种香豆素类活性成分进行分离测定，使之成为有用的质量控制指标。

天然药物中的香豆素类化合物的检测方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法、液质联用法及高效液相色谱法(HPLC)。迄今为止，还没有关于羽裂蟹甲草花中香豆素类化合物的HPLC分析的报道。因此，本文首次建立了羽裂蟹甲草花中香豆素类化合物的高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-PDA)的分离分析及含量测定方法，该方法简便、快捷、准确、可靠，可用于羽裂蟹甲草中香豆素类化合物的含量测定，并为该植物的开发利用和质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters高效液相色谱仪(包括Waters Delta 600四元梯度泵、2996二极管阵列检测器、手动进样器、Millennium32数据处理软件系统)，美国Waters公司；KQ-250B型超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司；CH-8606型微量分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2试药 7-羟基香豆素(HC)、7-羟基-8-甲氧基香豆素(HMC)和7β-D-葡萄糖-8-羟基香豆素(GC)对照品，均由作者从羽裂蟹甲草花中自行分离获得(质量分数均>98.0%)，结构经多种波谱技术确定，1H-NMR、13C-NMR数据与文献报道的相应化合物数据[8-12]一致。羽裂蟹甲草花于2001年8月采自甘肃省尖山乡，经西安交通大学牛晓峰教授鉴定为菊科(Compositae)蟹甲草属(CacaliaLinn.)羽裂蟹甲草[Cacaliatangutica(Franch.) Hand.-Mazz.]的花。甲醇、四氢呋喃(色谱纯)，美国Fisher公司；醋酸(分析纯)，西安化学试剂厂；水为自制二次重蒸水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-四氢呋喃-10 mL·L-1醋酸(27∶7∶66)；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：325 nm；进样量：10 μL；柱温：25 ℃；在线脱气：氦气。理论塔板数以HMC峰计算不低于10 000。

2.2溶液的制备

2.2.1单一对照品储备液 精密称取HC、HMC和GC对照品各2.0 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2混合对照品溶液 分别精密吸取2.2.1项下制备的3种单一对照品储备液2、1、0.5 mL，置于10 mL量瓶中，混匀，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得3种成分质量浓度分别为40、20、10 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液 精密称取阴干的羽裂蟹甲草花2.0 g，粉碎过3号筛，置于50 mL具塞锥形瓶中，用甲醇50 mL超声(功率250 W，频率40 kHz)提取2次，每次30 min，合并提取液，滤过后减压回收甲醇，所得浸膏用甲醇溶解并移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，经0.45 μm有机滤膜滤过，备用。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系及检测限的确定 精密量取2.2.1项下制备的3种单一对照品储备液适量，加甲醇逐步稀释成HC(120、80、40、20、10、5、2、1 μg·mL-1)，HMC(120、80、40、20、10、5、2、1 μg·mL-1)，GC(120、80、40、20、10、5、2 μg·mL-1)的单一对照品溶液，各溶液按照2.1项下色谱条件进样3次，取其峰面积的平均值。以对照品质量浓度为横坐标(x)、色谱峰面积的平均值为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到HC、HMC和GC标准曲线的回归方程分别为：y1=5.340×107x1+9.064×104(r1=0.999 8)，y2=5.580×107x2+2.580×104(r2=0.999 8)，y3=1.172×107x3+3.914×103(r3=0.999 9)。结果表明，3种化合物质量浓度分别在1～120、1～120、2～120 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。3种化合物的最低检测限(S/N=3)分别为1.3、1.0、2.8 ng，定量限(S/N=10)分别为4.2、3.4、9.0 ng。

2.3.2精密度实验 精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液10 μL，于同日内连续进样5次，以峰面积计算日内精密度，求得HC、HMC和GC峰面积的RSD值 (n=5) 分别为0.47%、0.92%、1.61%；连续5 d内(每日1次)进行测定，计算日间精密度，结果HC、HMC和GC峰面积的RSD值(n=5) 分别为1.83%、2.36%、2.51%，表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验 精密称取羽裂蟹甲草花样品5份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，3种化合物的平均含量分别为0.65、0.32、0.13 mg·g-1，RSD 值(n=5)分别为3.12%、2.70%、2.16%，表明实验重复性良好。

2.3.4稳定性实验 精密吸取2.2.3项下制备的供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、24 h进样分析，结果3种化合物峰面积的RSD值分别为0.74%、1.09%、1.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5回收率实验 称取6份含量已知的羽裂蟹甲草花样品1 g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中。精密称取3种化合物对照品6.2、2.9、1.2 mg，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。精密吸取该混合对照品溶液5 mL，加入上述具塞锥形瓶中，按照2.2.3项下方法制备溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验结果 (n=6)

2.4样品测定 精密吸取2.2项下制备的供试品溶液及混合对照品溶液各10 μL，进样测定，平行测定5份，按照外标法计算含量。测得羽裂蟹甲草花中HC、GC、HMC的含量分别为0.65、0.32、0.13 mg·g-1，RSD值分别为3.1%、2.7%、2.1% (n=5)。色谱图见图1。

图1 HPLC图

3 讨论

3.1检测波长的选择 文献报道[13-15]，对于香豆素类化合物所采用的检测波长为320 nm或采用其他波长，本实验采用二极管阵列检测器分别对进样后的HC、HMC和GC对照品溶液进行了全波长(200～400 nm)扫描，发现这3种化合物在325 nm波长处有最大吸收，因此选定325 nm作为检测波长。

3.2提取条件的选择 根据文献[16-18]，甲醇对于3种化合物具有较好的溶解性和提取效率，因此在本实验中选用甲醇作为提取溶剂。称取样品2.0 g，共3份，分别采用超声提取法、加热回流法、索氏提取法提取2 h，测定HC、HMC和GC的含量，结果超声提取法、加热回流法含量较高，而超声处理简单，故确定提取方法为超声提取法。同时，进行了提取次数的考察，取样品2.0 g，共4份，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，用甲醇50 mL分别超声提取1、2、3、4次(每次30 min)，测定HC、HMC和GC的含量，结果超声提取2次后，含量不再增加，故超声提取次数确定为2次。另外，对不同体积分数的提取溶剂也进行了考察，采用体积分数分别为80%、50%的甲醇和甲醇分别超声提取2次，每次30 min，结果表明，采用甲醇提取时样品中3种化合物的含量最高，故采用甲醇作为提取溶剂。

3.3流动相的选择 根据文献[15，19-20]，对于含有酚羟基的香豆素类化合物，流动相中加入少量酸能使峰形变得尖锐，本实验尝试在流动相中加入醋酸，分别以甲醇-10 mL·L-1醋酸和乙腈-10 mL·L-1醋酸作为流动相，采用等度洗脱或梯度洗脱，结果HC和HMC都难以分离或需要很长时间才能分离；在尝试用部分四氢呋喃代替甲醇作为改性剂后，取得了较好的分离效果。最终实验表明，采用甲醇-四氢呋喃-10 mL·L-1醋酸(27∶7∶66)作为流动相等度洗脱，流速为0.8 mL·min-1，12 min内就能将3种化合物很好地分离。

4 结论

香豆素类化合物是羽裂蟹甲草的有效化学物质，是含苯骈α-吡喃酮结构的芳香含氧杂环化合物，是重要的植物次生代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性，具有药用开发价值。本实验建立了测定羽裂蟹甲草花中3种香豆素类化合物的HPLC-PDA法，该方法简便、准确、选择性好，可为羽裂蟹甲草植物的开发利用和质量控制提供参考。