基于SIRT1通路研究白藜芦醇对青光眼大鼠视网膜的保护作用

熊云帆，李 琴

(1.云南省第二人民医院眼科，昆明 650021；2.昆明医科大学第一附属医院眼科，昆明 650000)

青光眼是临床常见的眼科疾病，表现为眼压升高、视力损害、视神经受压，其发病机制复杂，临床治疗难度大。沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)治疗青光眼的作用受到日益关注，该分子具有去乙酰化活性，通过调节下游p53和NF-κB等分子的去乙酰化从而发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。在青光眼患者的小梁网组织中，SIRT1的表达明显降低，且与炎症反应、氧化应激反应和细胞凋亡等的激活均密切相关[1-2]。因此，激活SIRT1也被认为是治疗青光眼的理想靶点。白藜芦醇(RES)是从虎杖和葡萄等植物中提取得到的天然多酚类化合物，也是目前已知最强的SIRT1激动剂，激活SIRT1通路后能在肝脏缺血再灌注损伤和视网膜缺血再灌注损伤中发挥保护作用[3-4]。本研究以青光眼大鼠为对象并基于SIRT1通路分析RES对视网膜组织的保护作用。

1 仪器与材料

1.1仪器 Topo-pen AVIA型眼压计，美国Reichert公司；T1600型凝胶成像仪，上海天能公司；ELX808型酶标仪，美国Bio-tek公司。

1.2试药 白藜芦醇(RES)，Sigma公司；水合氯醛，上海抚生实业有限公司；奥布卡因滴眼液，山东博士伦福瑞达制药有限公司；RIPA裂解液，上海碧云天公司；B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase-3)、沉默信息调节因子相关酶1(SIRT-1)、乙酰化p53和乙酰化NF-κB的单克隆一抗及HRP二抗，均购自Abcam公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的酶联免疫吸附(Elisa)试剂盒，均购自上海西唐公司。

1.3动物 30只雄性SD大鼠，8～10周龄，体质量为180～200 g，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0003。

2 方法

2.1分组、造模及给药 将大鼠随机分为对照组、模型组和RES组，每组10只。模型组和RES组建立青光眼模型：腹腔注射0.1 g·mL-1水合氯醛0.3 mL·kg-1麻醉，在颞上、颞下和鼻上象限沿着角膜缘剪开球结膜，分离巩膜上静脉并用532 nm激光烧灼巩膜缘周围巩膜浅层静脉环及分支，每眼烧灼约100个点，造模7 d后测眼压，眼压>22 mmHg为造模成功；对照组进行假手术操作。造模成功后，RES组腹腔注射RES 20 mg·kg-1，每日1次，连续21天时，对照组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射，连续21 d。

2.2眼压检测 在给药后第7、14、21天时，腹腔注射0.1 g·mL-1水合氯醛0.3 mL·kg-1麻醉后，用4 g·L-1奥布卡因滴眼液滴双眼，用Topo-pen AVIA眼压计测定眼压，每眼检测4次，计算平均值。

2.3基因表达检测 给药后21 d时，完成眼压检测后处死大鼠，解剖左侧眼球，分离视网膜组织，按照RIPA裂解液的说明书进行操作，分离组织中的蛋白，按照BCA试剂盒的说明书进行操作，测定蛋白含量。取含有20 μg蛋白的样本，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后电移至NC膜，在NC膜中放入0.05 g·L-1脱脂牛奶，室温孵育2 h，洗膜后将NC膜放入1∶1 000稀释的Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、SIRT-1、乙酰化p53和乙酰化NF-κB的一抗中，4 ℃孵育过夜；次日，洗膜后将NC膜放入1∶2 000稀释的HRP二抗中，室温孵育1 h，最后加入ECL并在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，根据蛋白条带的灰度值计算表达量。

2.4细胞因子含量检测 处死大鼠后解剖右侧眼球、分离视网膜组织后采用RIPA裂解液提取组织中的蛋白，采用Elisa试剂盒测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，采用BCA试剂盒测定蛋白含量，计算每毫克总蛋白中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

3 结果

3.13组大鼠眼压水平的比较 给药后7、14、21 d时，模型组大鼠的眼压水平与对照组比较均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；RES组大鼠的眼压水平与模型组比较均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠给药后眼压水平的比较

3.23组大鼠视网膜中凋亡基因表达的比较 给药后21 d时，与对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中Bax和Cleaved caspase-3的表达量均明显升高，Bcl-2的表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，RES组大鼠视网膜组织中Bax和Cleaved caspase-3的表达量明显降低，Bcl-2的表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图1。

表2 3组大鼠视网膜中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表达的比较

图1 3组大鼠视网膜中凋亡基因的蛋白条带

3.33组大鼠视网膜中炎症因子含量的比较 给药后21 d时，模型组大鼠视网膜组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量与对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；RES组大鼠视网膜组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量与模型组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠视网膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的比较

3.43组大鼠视网膜中SIRT1通路基因表达的比较 给药后21 d时，与对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中SIRT1的表达量明显降低，乙酰化p53和乙酰化NF-κB的表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，RES组大鼠视网膜组织中SIRT1的表达量明显升高，乙酰化p53和乙酰化NF-κB的表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4和图2。

表4 3组大鼠视网膜中SIRT1通路基因表达的比较

图2 3组大鼠视网膜中SIRT1通路基因的蛋白条带

3 讨论

青光眼是常见的致命性眼病，眼压升高后压迫视网膜、引起视网膜神经节细胞损害是致盲的主要原因，视网膜神经节细胞损害相关的机制十分复杂，可能的机制包括炎症反应及氧化应激反应的过度激活、细胞凋亡的加剧等[5-7]。RES是具有抗炎、抗氧化和抗凋亡活性的多酚类化合物，本研究将RES用于青光眼的治疗，旨在通过RES的药理学作用来减轻青光眼病程中视网膜神经节细胞的损害。在静脉烧灼操作后，模型组大鼠的眼压水平明显升高，说明造模成功，大鼠出现了青光眼典型的眼压升高症状；在造模后给予RES腹腔注射干预，给药后7、14、21 d时的眼压水平均明显降低，说明RES用于青光眼的治疗具有一定的降眼压作用，可能原因是RES的抗炎和抗凋亡作用改善了小梁网局部因炎症及凋亡而引起的变性和硬化，进而有利于房水流出并降低眼压。

视网膜组织中炎症反应和细胞凋亡的激活与神经节细胞的损害直接相关，在视网膜缺血再灌注损伤模型中，RES已被证实能够减轻视网膜组织的损伤[4]。本研究在使用RES治疗青光眼大鼠后，也观察了视网膜组织损伤的情况。细胞凋亡及炎症反应与青光眼病程中视网膜组织损伤的关系已经受到广泛认可[8-10]，因此，本研究分别通过视网膜中凋亡基因表达量及炎症细胞因子含量的检测来评价视网膜的损伤程度。Bax和Bcl-2是凋亡调控基因，前者增加了细胞色素C释放和促进了有活性的Cleaved caspase-3生成，进而促进凋亡的发生；后者拮抗Bax的功能并减少Cleaved caspase-3生成，进而抑制凋亡的发生[11-12]。TNF-α、IL-1β和IL-6是具有促炎活性的细胞因子，能够加重视网膜组织的炎症反应并引起组织损伤[13-15]。在本研究的青光眼大鼠视网膜中，具有促凋亡作用的Bax和Cleaved caspase-3表达量增多，具有促炎作用的TNF-α、IL-1β和IL-6含量也增多，而抗凋亡作用的Bcl-2表达量减少，与既往关于青光眼大鼠视网膜中凋亡及炎症激活的报道一致。在使用RES治疗后，视网膜中Bax、Cleaved caspase-3表达量及TNF-α、IL-1β和IL-6含量均减少，而Bcl-2的表达量增多，说明RES对青光眼大鼠视网膜中的细胞凋亡及炎症反应具有抑制作用。

近些年越来越多关于RES作用机制的研究证实，RES是SIRT1激动剂，其抗炎、抗氧化和抗凋亡等活性均与激活SIRT1通路有关[16-18]。SIRT1是具有去乙酰化作用的催化酶，能够催化下游分子发生去乙酰化，引起转录活性降低。促凋亡基因p53及炎症反应调控基因NF-κB是重要的SIRT1下游分子，SIRT1使p53及NF-κB发生去乙酰化后，相应分子的促凋亡及促炎效应减弱，进而表现出抗炎及抗凋亡作用[19-20]。在青光眼大鼠的视网膜组织中，SIRT1的表达量减少，下游乙酰化p53和乙酰化NF-κB的表达增多，提示SIRT1催化p53及NF-κB去乙酰化的作用减弱，相应的抗凋亡及抗炎作用也减弱，与青光眼大鼠视网膜组织中细胞凋亡及炎症过度激活的变化趋势吻合。RES具有激活SIRT1的作用，在使用RES治疗青光眼大鼠后，视网膜组织中SIRT1的表达量增多，下游乙酰化p53和乙酰化NF-κB的表达量减少，说明RES对青光眼大鼠视网膜在SIRT1通路具有激活作用，这也可能是RES在青光眼中发挥抗凋亡及抗炎作用的分子机制。

综上所述，RES对青光眼大鼠视网膜组织具有保护作用，能够降低眼压并抑制细胞凋亡和炎症反应；RES的上述保护作用与激活SIRT1通路有关，今后可通过联合使用SIRT1抑制剂或敲低SIRT1的方式来进一步验证RES发挥治疗作用的分子机制。