基于网络药理学研究复方银花解毒颗粒抗新型冠状病毒的潜在机制

张冬玲，何枢衡，吴建雄，刘 存，张雨茜，刘光大，张评浒*

(1.亿帆医药股份有限公司，杭州 310000；2.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，转化医学研究院，扬州大学医学院，扬州 225009)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒感染引发的急性呼吸道传染病，临床主要表现为发热、乏力、干咳，严重者可出现呼吸困难、呼吸窘迫综合征或脓毒症休克等。针对此疾病目前尚无特效药物，但根据我国前期的临床诊疗实践研究表明，基于古代中医辨证论治“时行瘟疫”的思想采用中药或中成药对COVID-19不同证型进行对症治疗具有一定疗效。其中基于汉代张仲景的“麻杏石甘汤”与清代吴鞠通的“银翘散”组方而成的金花清感颗粒、清肺排毒汤等在临床治疗轻症以及防止轻症向重症转化方面具有一定作用。因此，基于病毒的复制特点及感染引发细胞因子风暴诱发急性肺损伤与急性呼吸窘迫症(ARDS)的致病机制，采用网络药理学方法探讨此类方剂在临床治疗COVID-19中的潜在机制，对指导此类方剂的研发及其临床应用将具有非常重要的意义。

复方银花解毒颗粒是以“银翘散”为基础化裁而来，是临床常用于治疗普通感冒和流感的中成药处方，曾在2003年作为安徽省治疗非典型性肺炎(SARS)的预防和治疗用药，2020年为安徽省用于治疗COVID-19的推荐用药[1-2]。复方银花颗粒由青蒿、金银花、荆芥、薄荷、野菊花、大青叶、连翘、鸭跖草、前胡、淡豆豉10味药材制成，临床研究表明，此药对流感病毒感染引起的病毒性肺炎具有良好的疗效[3-6]。本文以复方银花解毒颗粒主要成分为基础，采用网络药理学方法通过“成分-靶点”的关联性分析其治疗COVID-19的潜在作用及机制，进而采用体外细胞模型验证其抗冠状病毒的药效作用，以期为该药的临床推广应用提供参考。

1 资料与方法

1.1网站数据库和分析软件 数据库包括中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP (http://Lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Pubchem有机小分子生物活性数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；Swiss Target prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 数据库；Chemspider (http://www.chemspider.com)化合物结构式查询数据库；Genecards (https://www.genecards.org)数据库；PANTHER (http://pantherdb.org) 数据库；STRING (https://string-db.org) 数据库；KOBAS 3.0数据库。使用的软件有Cytoscape 3.7.2软件等。

1.2成分筛选以及参数设定 本研究所采用的成分均是从TCMSP数据库中查询获得。输入“青蒿”、“金银花”、“荆芥”、“薄荷”、“野菊花”、“大青叶”、“连翘”、“鸭跖草”、“前胡”、“淡豆豉”搜索药材成分。本项研究中以口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)为指标筛选活性成分，并最终以有明确简化分子线性输入规范号(smiles号)及预测靶点的化学成分作为活性成分参与网络药理学分析[7]。

1.3疾病靶点的获取 本研究针对COVID-19预测靶点以Genecards数据库作为主要来源，并通过搜索COVID-19相关的治疗靶点及其相关文献的对比分析，建立治疗COVID-19有潜在作用的已知靶点信息表。

1.4化合物的靶点预测 本文采用Swiss Target prediction数据库预测主要活性成分的主要作用靶点，即首先利用Pubchem和Chemspider数据库导出化合物SDF或MOL格式结构式，再导入至Swiss Target prediction数据库中预测主要活性成分的作用靶点，然后利用Venny 2.1平台获得与治疗COVID-19存在交集的潜在靶点，最终获得活性成分与疾病共有靶标。

1.5网络的构建与分析 本文采用软件Cytoscape 3.7.2版本构建复方银花解毒颗粒治疗COVID-19的“成分-靶点”网络，并采用部分插件分析网络拓扑参数。

1.6基因的富集分析 本文采用PANTHER数据库对复方银花解毒颗粒活性成分中预测出与治疗COVID-19存在交集的靶点进行基因本体(GO)注释，并对其靶点蛋白的分子功能、生物进程和细胞成分进行注释；然后利用String数据库发掘蛋白间的相互作用，形成蛋白与蛋白相互作用网络图。在此基础上利用KOBAS 3.0数据库获得相关靶标蛋白的富集信息，并绘制出P<0.01的前20条通路高级气泡图。

2 体外药效验证与实验方法

本文以人冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43分别感染人肝癌Huh7细胞和人肺癌H460细胞为模型，以细胞病变保护效力实验为参考指标对复方银花解毒颗粒是否具有抗新型冠状病毒的作用进行了探讨。方法：Huh7和H460细胞按照1.5×104个·孔-1接种于96孔板中，过夜培养后分别将含有100 TCID50HCoV-229E和HCoV-OC43的病毒液滴入96孔板内感染细胞，加入含待测药物的维持液，待测药物以3倍稀释6～8个剂量的样品进行实验，待病毒对照组出现明显细胞病变时观察记录结果，并用Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制质量浓度(IC50)及选择指数(SI)，SI=IC50÷TC50(TC50为药物半数毒性质量浓度)，其中SI值高于1即为有效，SI值越大，药物越安全[8]。公式：

其中：A表示累积抑制率<50%的药物质量浓度；B表示累积抑制率>50%的抑制率；C表示累积抑制率<50%的抑制率；D表示lg稀释倍数。

3 结果与分析

3.1复方银花解毒颗粒活性成分筛选 通过TCMSP数据库获得复方银花解毒颗粒处方的化学成分，筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18，进一步剔除无明确smiles号和作用靶点的化合物，筛选到109个活性化合物(青蒿、金银花、荆芥、薄荷、野菊花、大青叶、连翘、鸭跖草、淡豆豉和前胡中分别含有18、15、9、9、7、8、18、4、2、19个)。山柰酚、木犀草素、槲皮素、豆甾醇、谷甾醇和β-谷甾醇为该药方中多味中药的共有成分，删除重复最终获得80个活性化合物参与后续网络药理学分析，见表1。

3.2化合物靶点和疾病靶点的获取 采用Genecards数据库对治疗COVID-19的相关靶点进行搜索，共得到相关靶点2 202个，其中“score≥15”的靶点有220个。将活性化合物SDF或MOL结构式导入Swiss Target prediction数据库中获得无重复的化合物靶点822个。

3.3化合物中与COVID-19疾病相关靶点预测 将化合物的预测靶点与疾病相关靶点进行比对查重，得到药物与疾病相互作用的共有靶点63个，按照相关性得分值由高到低依次排列，得分越高，说明与疾病关系越大，见表2。由表2可知，ACE、VEGFA、TNF、NOS3等得分较高的为治疗COVID-19的主要靶点。在靶点化合物的比对中发现，ACE为青蒿活性成分金色酰胺醇酯(MOL007415)的主要靶点，VEGFA为薄荷活性成分柚皮素(MOL004328)的主要靶点，TNF主要为鸭跖草中鸭跖黄酮苷(MOL006836)、前胡中茵芋苷(MOL013083)以及连翘中乳甾醇(MOL003365)的主要靶点，NOS3为前胡中丝立尼亭(MOL013098)、白花前胡甲素(MOL013079)、白花前胡香豆精Ⅱ(MOL013087)以及白花前胡素E(MOL013078)的主要靶点，MPO为槲皮素、山柰酚、脱氧青蒿素(MOL007426)、异鼠李素(MOL000354)、(+)-荷包牡丹碱(MOL000791)、木犀草素、芫花素(MOL005573)、条叶蓟素(MOL007401)、汉黄芩素(MOL000173)、香叶木素(MOL002881)、金合欢素(MOL001689)等活性成分的共有靶点，来源于多种药材，提示青蒿、薄荷、鸭跖草、连翘、前胡在治疗COVID-19中具有重要意义。

表2 活性化合物与COVID-19的共有靶点

3.4“成分-靶点”网络构建 在不同数据库中搜索活性化合物所对应的靶点，筛选出重复后得到化合物靶点，构建“成分-靶点”可视化图，见图1。由图1可知，其中黄色表示化合物靶基因，红色节点表示活性化合物，边则表示化合物与靶点的相互作用关系，节点度(Degree)是指和该节点相关联的边的条数，节点度越高，说明该化合物或靶点在该网络中越重要，在此网络图中共有活性化合物76个，边657条，平均节点度值为8.6。在化合物中值最高的是化合物N-阿魏酰酪胺(MOL006834)，来源于鸭跖草，节点度值高于15的化合物主要来源有鸭跖草、金银花、青蒿、连翘、野菊花、薄荷等。见表3。

图1 “成分-靶点”网络图

表3 节点度>15的活性化合物及对应药材分析

3.5共有靶点的GO分析 为了进一步观察复方银花解毒颗粒治疗COVID-19的分子机制，对共有靶点进行GO分析，采用PANTHER软件对63个共有蛋白进行GO注释以评估其参与的生物进程、分子功能和细胞组分，见表4。生物进程图表明与这些蛋白参与代谢、免疫调节、生物黏附、应激反应以及细胞增殖有关。分子功能图显示蛋白主要的功能是转录调节活性、催化、分子传导以及传导调控等功能；细胞组分显示蛋白主要是由细胞膜、蛋白质复合物以及膜部件和细胞器等成分组成。利用String数据库构建蛋白与蛋白相互作用网络，见图2。由图2可知，网络图中的连线为已被证实的蛋白间相互作用，STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、AR、MMP3等蛋白参与的信号网络较多，在通路调控中发挥重要作用；而ACE、ADA、CCL2、SCN5A、HMGCR等蛋白较为孤立，需要进一步研究。

表4 复方银花解毒颗粒与COVID-19的共有靶点GO分析

图2 复方银花解毒颗粒与COVID-19共有靶点蛋白相互作用图

3.6信号通路富集分析确认关键靶标和通路 利用 KOBAS 3.0数据库对复方银花解毒颗粒治疗COVID-19的63个共有蛋白进行通路富集分析，选取了P<0.01的前20条通路，分别与肿瘤信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、甲型流感信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染、C型凝集素受体信号通路、人乳头瘤病毒感染、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎等信号有关，分析发现，复方银花解毒颗粒的富集通路与清肺排毒汤富集通路基本相似[9]，提示复方银花解毒颗粒具有潜在治疗COVID-19的作用。

3.7复方银花解毒颗粒体外抗冠状病毒的药效作用验证 本研究结果表明，复方银花解毒颗粒在无明显毒性剂量条件下对HCoV-229E和HCoV-OC43感染所致的细胞病变具有良好的保护作用，见表4。由表4可知，复方银花解毒颗粒对HCoV-229E感染Huh7细胞和对HCoV-OC43感染H460细胞所致细胞病变具有较好的保护作用，其IC50分别为438.16±166.04、165.13±28.37 μg·mL-1，治疗指数SI分别为4.64、17.78。以上结果提示，复方银花解毒颗粒在无毒性剂量条件下对人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变均具有较好的保护作用。

图3 复方银花解毒颗粒与COVID-19共有靶点通路富集的气泡图

表4 受试药物对HCoV-229E感染Huh7细胞所致病变的保护作用

4 讨论

复方银花解毒颗粒由治疗“时行感冒”的临床经典方“银翘散”优化组方而来，其组方选药以辛凉清解治法为依据，具有疏表透邪、轻宣肺气的作用，且有清热解毒之功。鉴于COVID-19具有与古代“时行感冒”临床症状及病程转归类似的特点，本文采用网络药理学方法对复方银花解毒颗粒是否具有治疗COVID-19的作用及其潜在的机制进行了预测分析，结果预测到从复方银花解毒颗粒中筛选出的80个活性化合物存在 822个作用靶点，而预测到的COVID-19相关靶点2 202个，其中药物与COVID-19存在交叉的共有靶点341个，得分>15分的靶点为63个，靶点指认化合物共76个，提示复方银花解毒颗粒中绝大多数活性化合物都参与到COVID-19的抑制过程中。

网络药理学分析表明，青蒿在抑制COVID-19靶点上发挥了重要作用，条叶蓟素、茵陈黄酮和蓟黄素靶点与COVID-19一致的分别有17、16、16个，青蒿中其他成分青蒿素、青蒿素Ⅰ、青蒿素Ⅱ、脱氧青蒿素、青蒿素Ⅳ、青蒿素Ⅴ、青蒿醇、蒿黄素、中国蓟醇、鼠李素、山柰酚、槲皮素、木犀草素和万寿菊素指认COVID-19靶点也较多。有文献报道，青蒿素对新型冠状病毒具有抑制作用[10]，青蒿鞣制具有抗病毒活性[11]，青蒿制剂具有抗猪流感病毒的作用[12]。本研究也发现，青蒿活性化合物诸多靶点与COVID-19靶点一致，其活性成分异鼠李素经分子对接证明与新型冠状病毒亲和力较高[13]，其他与多种药材(金银花、青蒿、荆芥、野菊花、连翘)共有的活性成分如槲皮素、山柰酚、木犀草素等也经分子对接等证实与新型冠状病毒受体有较高吻合度[13-15]；提示青蒿在复方银花解毒颗粒治疗COVID-19中可能发挥重要作用。本次分析发现，鸭跖草、薄荷等药材活性成分指认COVID-19靶点也较多，有文献证明，鸭跖草水提物能够抗流感病毒[16]。袁琦等[17]研究发现，鸭跖草不同提取物能够抗呼吸道合胞病毒(RSV) 和单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)，鸭跖草抗病毒作用可能与其能够抑制α-葡糖苷酶活性有关。徐佳馨等[18]报道薄荷能够抗单纯疱疹病毒、抗呼吸道合胞病毒，薄荷水提物对牛痘病毒、孤儿病毒、Semliki森林病毒和流行性腮腺病毒均有抑制作用，薄荷中的芫花素能够抑制非洲猪瘟病毒[19]，与其他药材共有的活性成分槲皮素能够抗疱疹病毒和流感病毒[20]。以上分析表明，金银花、青蒿、荆芥、野菊花、连翘、鸭跖草、薄荷等在复方银花解毒颗粒治疗COVID-19中具有重要作用，体现了中药多组分、多靶点的临床优势。

GO分析发现STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、AR、MMP3等蛋白参与的信号网络较多，参与各项药理活动较为活跃，KEGG富集分析发现靶点参与了卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、甲型流感信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染、C型凝集素受体信号通路、人乳头瘤病毒感染、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎等信号通路，显示了复方银花具有抑制病毒、抗炎、免疫的作用。

本研究以人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E体外感染细胞为模型，首次对复方银花解毒颗粒抗冠状病毒的药效作用进行了探讨。结果表明，复方银花解毒颗粒在无毒性剂量条件下对人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变均具有较好的抑制作用。

综上所述，复方银花解毒颗粒治疗COVID-19能通过其有效活性成分青蒿素、异鼠李素、芫花素、槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于STAT1、MAPK1、EGFR、RAF1、PTPN11、VEGFR、CASP8、AKT1、NOS3、ACE、CCL2等靶点,调控甲型流感信号通路、IL-17信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染、人乳头瘤病毒感染、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎等信号通路，抑制COVID-19，改善肺炎患者的临床症状。本研究从网络药理学角度首次阐述了复方银花解毒颗粒的多成分、多靶标调控机体信号通路发挥抗多种病毒的潜在作用机制，为探讨该药临床用于治疗病毒性肺炎的潜在机制与作用靶标提供了新思路。