原花青素复合物的降血脂作用及其含量测定

杨晓君，周 静，谢 元，买迪娜木·阿布力米提，张玉君，武 运

(新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

葡萄皮渣作为葡萄酒生产中的主要废弃物，约占葡萄原料总质量的20%～30%，多被企业丢弃或作为饲料[1-2]，不仅污染环境，而且浪费资源。近年来，从葡萄加工副产品中提取生物活性物质已成为研究热点[3]。葡萄皮渣中含有丰富的多酚类物质，其中以原花青素(OPC)的含量最为丰富[4]，1994年已发现，OPC可降低血清三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，具有改善动脉粥样硬化、维持脂质稳态的作用[5]。白藜芦醇(Res)在酿酒过程中大部分残留于酿后皮渣中，具有改善代谢紊乱、抗衰老、保护心血管等作用[6-8]。酿后葡萄籽油(GSO)含有丰富的亚油酸和多酚[9-10]，可降低血清LDL-C水平并升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平[11]，具有保护心血管、抗癌、抗氧化等多种生物活性[12-13]，可作为高级优质食用油，有加工利用的价值。

高脂血症以血清总胆固醇(TC)、TG和LDL-C水平升高为主要特征，近年来已成为严重威胁我国公民健康的病症之一，而以具有降血脂效果的天然产物作为膳食干预改善高脂血症，可避免因长期服用药物产生的不良反应[14]。OPC、Res和GSO均具有改善血脂水平的作用，但三者的复配是否具有协同降血脂作用尚未知。另一方面，OPC作为低聚黄烷化合物具有一定的脂溶性，且Res和OPC均不耐热与光，二者可在GSO中形成乳状分散物，有助于二者的保存[15-16]。

析因实验设计是一种多因素的交叉分组实验，可比较各因素、各水平间的差异和各因素间的交互作用，寻找最佳组合[17]。本文设计2×2×2析因实验探讨OPC、Res和GSO复合物对于高脂血症小鼠降血脂效果的交互作用，并采用HPLC法确定复合物中OPC和Res的准确剂量。

1 仪器与试药

1.1仪器 X-Mark型酶标仪(伯乐生命医学产品上海有限公司)；高效液相色谱仪(包含DGU-20A HPLC泵、SIL-20A进样系统，SPD-M20A检测系统，CTO-20A柱温箱，日本岛津公司)；Kromasil C18色谱柱(北京宝赛希望生物科技有限公司)。

1.2试药 葡萄皮渣(自制)；原花青素对照品、白藜芦醇对照品(质量分数>95%)，白藜芦醇(质量分数>97%)，均购自大连美仑生物有限公司；丙硫氧嘧啶(上海蓝季生物有限公司)；正己烷、环己烷、氯化钠(天津市致远化学试剂有限公司)；柠檬酸三钠、乙二胺四乙酸(天津永晟化工有限公司)；胆固醇(成都市科隆化工试剂厂)；丙硫氧嘧啶(上海蓝季科技发展有限公司)；吐温-80、丙二醇、硫酸高铁铵、正丁醇、石油醚，均购自天津市福晨化学试剂厂；胆酸钠(南京奥多福尼生物有限公司)；灭菌全价颗粒饲料，由新疆医科大学实验动物中心提供；TG测试盒、TC测试盒、LDL-C测试盒、HDL-C测试盒，均购自南京建成生物试剂研究所。

2 方法

2.1复合物的制备

2.1.1OPC的制备 参照文献[18]方法并加以修饰。称取酿后葡萄皮渣粉末25 g，加入混合试剂(无水乙醇∶10 mL·L-1盐酸=95∶5)500 mL，置于圆底烧瓶中，60 ℃水浴回流100 min，重复提取2次，合并滤液，减压浓缩后冷冻干燥，即得OPC样品，4 ℃储存，备用。

2.1.2GSO的制备 称取葡萄皮渣粉末20 g，分别加入正己烷和环己烷21、139 mL，于80 ℃水浴2 h后，减压浓缩至无溶剂，即得GSO粗油。取GSO粗油，加入质量分数为15%的复合盐(一定比例的氯化钠、柠檬酸三钠和乙二胺四乙酸混合制成)进行脱磷，脱磷液以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得GSO样品，4 ℃储存，备用。

2.1.3复合物的配制 精密称取上述制备的OPC、GSO样品和Res，置于烧杯中，超声混匀，即得。

2.2高脂血症动物实验

2.2.1高脂乳剂的配制 称取猪油融化，加入胆固醇和丙硫氧嘧啶搅拌，添加吐温-80和丙二醇，再缓慢加入胆酸钠溶液，研磨，加水混匀，即得[18]。

2.2.2分组与造模 选用体质量18～22 g的健康雄性KM小鼠(实验动物许可证号SCXK[新]2016-0001)，适用性喂养1 周后随机分为对照组、高脂组和8个实验组，每组12只。对照组灌胃去离子水，高脂组和实验组每日灌胃高脂乳剂，剂量为0.01 mL·g-1。10 d后，按照给药剂量分别给予复合物溶液40 d。小鼠每周称定1次体质量，自由进食进水，末次给药后禁食不禁水。

2.2.3剂量设计 按照文献[19-21]，设置OPC高、低剂量(200、100 mg·kg-1)，Res高、低剂量(100、50 mg·kg-1)，GSO高、低剂量(30、20 mg·kg-1)。析因实验设计及各组给药剂量见表1和表2。

表1 2×2×2析因实验设计

表2 各组给药剂量

2.2.4血脂指标的测定 各组小鼠眼眶采血，分离血清，按照试剂盒说明书分别检测血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平。

2.3复合物中OPC和Res的含量测定

2.3.1溶液的配制

2.3.1.1OPC对照品溶液 采用高铁盐催化法[22]制备。精密称取OPC对照品10 mg，加甲醇溶解并配制成质量浓度为1 mg·mL-1的OPC储备液。精密吸取上述储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定溶至刻度，再分别吸取1 mL，加入0.2 mL硫酸高铁铵溶液和8.8 mL正丁醇，摇匀，水浴加热1 h，用正丁醇定容，即得OPC系列对照品溶液。

2.3.1.2Res对照品溶液 精密称取Res对照品10 mg，加甲醇溶解制成质量浓度为1 mg·mL-1的Res储备液。精密吸取上述储备液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mL，分别置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得Res系列对照品溶液。

2.3.1.3OPC供试品溶液 精密称取2.1.3项下制备的复合物溶液2.2 mg，加入石油醚溶解，置于分液漏斗中，用甲醇萃取2次，取下层溶液加入甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，得萃取液。取萃取液，按照2.3.1.1项下方法制备OPC供试品溶液。

2.3.1.4Res供试品溶液 取2.3.1.3项下制备的萃取液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.3.2色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(45∶55)；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；OPC、Res检测波长分别为550、306 nm。

2.3.3样品含量计算 复合物中OPC和Res的含量计算公式为：P=(C×V×N)÷M。

式中，P为OPC或Res含量(mg·g-1)；C为供试品溶液质量浓度(μg·mL-1)；V为体积(mL)；N为稀释倍数；M为复合物质量(mg)。

3 结果与讨论

3.1小鼠体质量变化 实验采用高脂乳剂建立高脂血症小鼠模型，实验过程中小鼠未出现明显不适。小鼠体质量变化见表3。由表3可知，经40 d高脂乳剂喂养的高脂组小鼠体质量显著高于对照组(P<0.01)，在给予复合物喂养后，各组小鼠体质量相对高脂组均显著降低，表明各实验组均能够改善小鼠肥胖，其中效果最为显著的组别为A1B1C1和A2B1C2组。

表3 实验中各组小鼠体质量变化

3.2复合物对高脂小鼠血脂水平的影响 胆固醇稳态对于维持血脂水平具有重要作用，高胆固醇会增加心血管疾病的风险，并与缺铁性中风呈正相关[23]。各组小鼠血脂检测结果见表4。由表4可知，与对照组相比，高脂组小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均显著升高，表明成功建立以高胆固醇为主要特征的小鼠高脂血症模型。与高脂组相比，各实验组均能显著降低TC、TG和LDL-C水平，其中，降TG、TC、LDL-C水平效果最好的分别是A2B1C2、A2B1C1和A2B1C1组。

表4 OPC复合物对高脂血症小鼠血脂含量的影响

3.3实验结果析因分析

3.3.1OPC、Res和GSO对小鼠TG水平的影响 见表5。由表5可知，OPC、Res和GSO存在交互作用；结合表4和表5可知，降低TG水平的最佳组合为A2B1C2(P<0.01)。

表5 OPC、Res和GSO对小鼠TG水平的影响

3.3.2OPC、Res和GSO对小鼠TC水平的影响 见表6。由表6可知，Res和GSO的交互作用对于TC影响显著(P<0.05)，结合表4和表6可知，对TC作用显著的最优组合为A2B1C1。

表6 OPC、Res和GSO对小鼠TC水平的影响

3.3.3OPC、Res和GSO对小鼠LDL-C水平的影响 见表7。由表7可知，OPC、Res和GSO组合对于LDL-C交互作用明显(P<0.05)。结合表4和表7可知，对LDL-C作用显著的组合为A2B1C1。

表7 OPC、Res和GSO对小鼠LDL-C水平的影响

综合上述分析，OPC对于高脂血症小鼠TG、TC和LDL-C水平均存在显著影响(P<0.01)，Caimari A等[20]研究表明，低剂量的葡萄籽OPC提取物(25 mg·kg-1)喂食高脂饮食仓鼠15 d即可显著避免脂肪积累，改善血脂水平，表明OPC在复合物降血脂作用中处于主要地位。而OPC、Res和GSO三者复配对于小鼠TG和LDL-C水平存在显著交互作用(P<0.05)，协同降血脂效果显著优于单一成分。推断最佳降血脂组合为A2B1C1，即OPC、Res和GSO分别 200、50、20 mg·kg-1。

3.4复合物中OPC和Res的含量测定 HPLC法测定复合物中OPC和Res含量，确定复合物中OPC和Res对小鼠降血脂作用的准确剂量，为复合物质量的分析检测提供参考。

3.4.1OPC和Res的HPLC图 见图1。

图1 HPLC图

3.4.2OPC和Res的含量测定结果 以峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)，得OPC和Res的线性方程分别为y1=253.22x1+27 285(r1=0.999 1)，y2=110 792x2-72 966(r2=0.999 8)，线性范围和检出限(S/N=3)见表8。按照2.1.3项下方法平行配制3份复合物溶液，分别测得复合物中OPC和Res含量分别为26.5%、23.8%，精密度RSD值分别为0.59%、0.29%。按照2.1.3项下方法平行配制6份复合物溶液，按照50%加样回收进行HPLC检测，测得复合物中OPC和Res的加样回收率分别为101%、105%，符合理化分析要求。

表8 OPC和Res的含量检测结果

OPC的常用检测方法有香草醛-盐酸检测法和高铁盐检测法，本实验采用高铁盐-HPLC检测法，其特点是对酸度不敏感，影响小、反应稳定性和重复性好[24-25]。OPC极易受热损失，研究表明[26]，60 ℃条件下加热48 h时OPC含量出现显著下降；另一方面，在复合物溶液的配制过程中，GSO可能将OPC提取物和Res包合形成微胶囊，因此，为使测试物最大限度析出，实验中严格把控加热温度和时间，采取先以石油醚扩大复合物体积，OPC和Res在甲醇中的溶解度大于在石油醚中的溶解度，因此再用甲醇萃取得到OPC和Res，可使检测结果更准确。

4 结论

本文通过2×2×2析因实验，首次讨论OPC、Res和GSO复配对于高脂血症小鼠降血脂效果的交互作用，结果表明，三者复配具有协同降血脂功效，其中影响最大的是OPC提取物的浓度，并确定复合物中OPC、Res与GSO降血脂的最佳剂量分别为200、50、20 mg·kg-1。进一步采用高铁盐-HPLC法测定了复合物中OPC和Res的含量分别为26.5%、23.8%。本研究将为利用酿后葡萄皮渣开发高品质、高价值的降血脂功能性食品提供参考，为其产业化发展、质量标准的建立奠定理论基础。