安神益智合剂对力竭游泳小鼠抗疲劳作用的机制

彭晓明，霍仕霞，高 莉，斯拉甫·艾白*

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830011；2.新疆生产建设兵团中心血站，乌鲁木齐 830000)

疲劳是一种日常普遍存在、涉及多种生理生化因素的疾病状态，是机体脑力或体力到达一定程度必然出现的生理现象。据WHO统计显示，全球约有超过35%以上的人群处于疲劳状态，其中中年男性人群疲劳状态达到60%。

目前抗疲劳药物或保健品多为大脑皮层兴奋类，如咖啡因、牛磺酸、苯丙胺和哌甲酯等。安神益智合剂由干姜、黑胡椒、荜茇、肉桂、余甘子、毛诃子肉、白花丹、广防己、中亚白及、奶桃、白皮松子仁、洋甘菊和红葡萄干等药材制成，是经典的民族药复方制剂，临床主治失眠，本研究参照《保健食品检验与评价技术规范》中缓解体力疲劳功能检验方法制备小鼠力竭游泳运动性疲劳模型[1]，观察安神益智合剂对力竭游泳小鼠的抗疲劳作用及其可能机制。

为了确保会计人员的继续教育质量，做到管理、考核、培训有效分离。通过构建社会中介组织来监督、检查、考核培训单位的教学质量和教学场所以及师资配备情况。在进行会计员考核过程中，除了培训单位对会计人员进行考核之外，企业还应定期对会计人员进行上岗考核，每年的继续教育培训或新政策出台之后，都要对会计人员进行考核，只有取得合格证书的人员才能在企业工作，对于考核不合格的会计人员，进行警告，警告后考核仍然不达标，吊销其会计资格证书。在培训单位参加培训的会计人员，必须建立完善的学习档案，及时了解会计人员参与培训的动态，切实提升其培训效果。

1 仪器与材料

1.1仪器 XD-101 型倒置显微镜(中国江南光电有限公司)；BIO-RAD550 型酶标仪(美国伯乐公司)；BECKMAN型高速低温离心机，Gene Amp PCR仪，均购自美国 PE 公司；BS224S型电子天平 [赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；DYCP-31CN 型琼脂糖水平电泳仪，DYY-6D型垂直电泳仪，均购自北京六一仪器厂； RNA/DNA 检测仪(Pharmacia Biotech公司)；3500R型凝胶成像系统(上海天能公司)；ST-I型半干式转移电泳槽(大连竟迈生物科技有限公司)。

1.2试药 安神益智合剂水提物(批号20160910)，自制。干姜(批号20141020)、黑胡椒(批号20150902)、荜茇(批号20140323)、肉桂(批号20150611)、余甘子(批号20140919)、毛诃子肉(批号20151002)、白花丹(批号20150930)、广防己(批号20140721)、中亚白及(批号20140611)、奶桃(批号20140603)、白皮松子仁(批号20150118)、洋甘菊(批号20150421)、红葡萄干(批号20141223)等药材，均购自新疆和田麦迪森维药有限公司，经霍仕霞主任鉴定为正品。诺迪康胶囊(批号160305)，四川诺迪康威光制药有限公司。乳酸(LD)测试盒(批号20161104)、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(批号20161101)、血尿素氮(BUN)测试盒(批号20161018)、小鼠睾酮(T)酶联免疫试剂盒(批号20161123)、小鼠皮质酮(C)酶联免疫试剂盒(批号20161123)，均购自南京建成生物工程研究所。Trizol、TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒以及DNA Marker、PCR Master Mix、Taq酶，均购自北京天根生物科技有限公司。

1.3动物 雄性清洁级ICR小鼠60只，体质量为16～20 g，购自新疆医科大学实验动物中心(合格证号：65000700000630)，温度为20～22 ℃，每12 h明暗交替1次，适用性饲养2～3 d。

2.2动物分组及给药方法 将60只ICR小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(诺迪康0.28 g·kg-1)和安神水提物低、中、高剂量(0.108 2、0.540 1、1.082 0 g·kg-1)组，每组10只。连续口服给药14 d。正常组小鼠不做处理，模型组给予等体积的蒸馏水。所有药物均以蒸馏水混悬配制，给药期间，小鼠自由饮水和摄食，每隔3 d称定1次体质量。

1.4引物 利用Oligo 6.0和Primary Primier 5.0软件设计目的基因CYP11A1、CYP17A1引物。CYP11A1：上游5′-TTC CTT TGA GTC CAT CAG CA-3′，下游5′-CAC TGG TGT GGA ACA TCT GG-3′；CYP17A1：上游5′-TGG TCA TAT GCA TGC CAA CT-3′，下游5′-CCC TTC TTC ACG AGC ACT TC-3′，实时定量PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

体育游戏教学法作为一种新颖的教学方法，对学生的兴趣产生了极大的影响，它能够有效地将老师和学生结合在一起，保证学生始终都能以最积极的状态来接受每一项教学内容。教师作为游戏教学法的组织者和实施者，要积极的引导学生适应这种教学方法，尽量做到根据每个学生的特点来设计适合的体育游戏活动，充分发挥学生的主观能动性，在促进学生增强身体素质的同时也要注重学生德智体全面发展。

2 方法

总之，现代企业为实现持续发展目标并获得更大经济效益，做好财务预算编制管理与执行管理工作是基础，对业务运营模式进行合理规划，最终实现预设的财务管理目标。应严格落实财务预算编制流程并加强对相关部门的管理，进而为预算编制工作有效开展奠定基础。并加强预算的执行情况，建设相关制度或体制或加强人员培训等，为预算目标早日实现贡献力量。

Application of a bias correction scheme for 2-meter temperature levels over complex terrain

2.3小鼠力竭游泳时间测定 小鼠末次给药30 min后，除正常组外，其余小鼠均在距尾根部1 cm处负荷5%体质量的铅皮，将其置于体积为37 cm×37 cm×50 cm、水深4 cm、水温为24～26 ℃的游泳箱中游泳。放于水中后立即计时，至小鼠头部没入水面10 s不浮出，即为小鼠力竭游泳时间。

孟导把这个小疑问暂时抛在脑后，急忙发问：“既然是乾隆年间的古钱，再怎么也有几百年了吧，怎么就不值钱？”

2.1安神益智合剂水提物的制备 将干姜、黑胡椒、荜茇、肉桂、余甘子、毛诃子肉、白花丹、广防己、中亚白及、奶桃、白皮松子仁、洋甘菊和红葡萄干药材按照处方比例混合并研成粗粉后，加入10倍量水浸泡30 min，回流提取2次，每次2 h，提取液过滤浓缩后，干燥成浸膏，即得安神益智合剂水提物(每克含生药17.329 mg，简称安神水提物)。

3.1对小鼠体质量变化的影响 见表1。由表1可知，各组小鼠0、3、6、9、12、14 d的体质量比较无明显变化(P>0.05)。

2.6CYP11A1、CYP17A1的蛋白表达 称取小鼠肌肉组织0.02 g，利用Inventbiotech离心柱法提取肌肉组织中的总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并将各组蛋白浓度调整为一致。提取的蛋白加入Loading buffer，并在沸水浴中变性5 min，在100 g·L-1的SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳，电泳结束后，将蛋白移至PVDF膜上，分别将CYP11A1、CYP17A1与PVDF膜温育过夜，用TBST洗涤3次，每次15 min，加入HRP链接的二抗在37 ℃温育1 h，用TBST洗涤3次，在暗室将荧光剂A液(4克双草酸酯与50 mL邻苯二甲酸二丁酯置于锥形瓶中，水浴使溶解后，冷却后即得)、B液(30 mL叔丁醇与20 mL体积分数为30%的过氧化氢混合，加入微量水杨酸，混合即得)，立即加到膜上0.8 mL，混匀液体，反应1 min，吸去多余荧光剂，将膜固定到曝光盒中，盖紧盒盖，曝光0.5～5 min；在显影液、定影液中显影和定影；比照曝光板上的膜记录Marker和各条带的位置，凝胶成像系统扫描条带[4]。

2.4相关生化指标的检测 各组小鼠力竭游泳结束30 min后，摘眼球采血，分离血清，测定LD、LDH、BUN含量和睾酮/皮质酮(T/C)比值。解剖取肝脏和腓肠肌，经生理盐水漂洗后，用滤纸吸干，测定肝糖原和肌糖原含量[2-5]。

3 结果与分析

2.5CYP11A1、CYP17A1的基因转录 称取小鼠肌肉组织0.1 g，利用Trizol法提取肌肉组织中的RNA，电泳验证RNA的完整性。通过TAKARA公司的AMV反转录试剂盒进行反转录反应。使用QIAquick PCR Purification Kit进行cDNA纯化。将纯化cDNA按照1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍浓度做梯度稀释，使用Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG试剂进行Realtime PCR(Bio-Rad CFX96)生成CYP11A1和CYP17A1基因的标准曲线。定量表达结果依据CT数值，根据2-△△CT法，计算其相对表达量。2-△△CT=[(CT目的基因-CT内部对照)]样本A-[(CT目的基因-CT内部对照)]样本B[4]。

表1 小鼠体质量的变化

㉜M.Sebastiano Erizzo.Discorso sopra le medaglie degli antichi：con la dichi aratione delle monete consulari e delle medaglie degli Imperadori Romani,Venice (Varisco&Paganini),1559;Trattato di messer Sebastiano Erizzo,dell'istrumento et via inventeur de gli antichi,Venice,1554.

表2 小鼠力竭游泳的时间

3.3对力竭小鼠血清中LD、LDH、BUN含量和T/C比值的影响 见表3。由表3可知，与正常组比较，模型组小鼠血清中T/C比值显著降低(P<0.01)，而LD、LDH和BUN含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，安神水提物各剂量组小鼠血清中T/C比值显著升高(P<0.01)，安神水提物低、中剂量组小鼠血清中LD和BUN含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，安神水提物各剂量组小鼠血清中LDH含量均显著降低(P<0.01)。

3.2对小鼠力竭游泳时间的影响 见表2。由表2可知，除正常组外，其他各组均进行一次性力竭游泳。与模型组比较，安神水提物中、高剂量组和阳性对照组均可显著延长小鼠力竭游泳时间(P<0.05，P<0.01)。

表3 安神水提物对力竭游泳小鼠血清LD、LDH、BUN含量和T/C比值的影响

3.4对力竭小鼠肌糖原、肝糖原含量的影响 见表4。由表4可知，与正常组比较，模型组小鼠肝糖原和肌糖原含量均显著下降(P<0.01)；与模型组比较，安神水提取物中、高剂量组和阳性对照组小鼠的肝糖原含量显著升高(P<0.01)，安神水提取物各剂量组和阳性对照组小鼠肌糖原均显著升高(P<0.05，P<0.01)。

表4 安神水提物对力竭小鼠肌糖原、肝糖原含量的影响