Box-Behnken效应面法优化穿心莲内酯自微乳的工艺

龙凯花，王春柳，李 晔*，张 红，刘 洋，孙婷婷，宗时宇

(1.西安培华学院，西安 710125；2.陕西省中医药研究院， 西安 710003)

穿心莲内酯为爵床科穿心莲属植物穿心莲(Andrographispaniculata)全草或叶中的主要药效成分之一，具有清热解毒和消炎止痛的作用[1-2]，临床主治急性痢疾、胃肠炎、上呼吸道感染和感冒发烧等[3]，但由于穿心莲内酯味极苦，难溶于水，口服生物利用度低，临床应用受到限制[4]。前期通过穿心莲内酯油水分布系数(P)和溶解度实验[5]，测得其P值为(35.64±0.30)，lgP为1.55，当-1.0

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Sartorius BP211D 型电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯天平有限公司)；HJ-6型多头磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)；ZEN3600型激光粒度仪(英国Marloven公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；FOEA26810D型超纯水系统(法国Millipore公司)；KQ-250DE型超声波清洗器(200 W，40 KHz；昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 穿心莲内酯原料药(西安天一生物科技有限公司，质量分数为98.0%，批号 TYM140216)；穿心莲内酯对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数为98.7%，批号110797-201108)；油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944 CS，批号201006)和二乙二醇单乙基醚(TranscutoL HP，批号145177)，均购自法国嘉法狮公司；聚乙二醇硬脂酸酯(Kolliphor®HS 15，德国巴斯夫公司，批号29749816K0)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1穿心莲内酯自微乳的制备 精密称定穿心莲内酯原料药、乳化剂、助乳化剂、油相，分别混合乳化剂和助乳化剂、油相和穿心莲内酯，置于37 ℃水浴中，将含药的油相缓慢加入混匀的混合乳化剂中，中速磁力搅拌10 min至澄清透明，即得穿心莲内酯自微乳(空白自微乳处方中除了不加穿心莲内酯外，其余步骤不变)。

2.2处方的初步筛选

2.2.1基质种类的筛选 按照2.1项下空白自微乳的制备方法，将不同比例配伍的乳化剂及助乳化剂混合，滴入不同油相，根据外观及滴入水中的现象，确定聚乙二醇硬脂酸酯为乳化剂，二乙二醇单乙基醚为助乳化剂，油酸聚乙二醇甘油酯为油相。其余滴入水中均出现乳白色溶液，无法形成稳定的自微乳体系。

2.2.2基质用量范围的筛选 将乳化剂聚乙二醇硬脂酸酯与助乳化剂二乙二醇单乙基醚振荡混匀，两者质量比(Km)为3∶2、2∶1、1∶1、1∶2、2∶3，混匀后分别与油相油酸聚乙二醇甘油酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例振荡混匀，滴水观察。以Km、水和油相分别为一角，绘制伪三元相图。见图1。通过观察是否澄清透明及加入水后是否形成淡蓝色乳光确定微乳区界限，形成自微乳区域。

由图1可知，Km在1∶2、2∶3的范围变化时，无法形成澄清透明淡蓝色乳光的自微乳溶液，缓慢加水后均形成带淡蓝色乳光的半浑浊溶液；Km在1∶1、3∶2、2∶1范围变化时，可以形成澄清透明淡蓝色乳光的自微乳溶液，且Km在3∶2、2∶1时形成的自微乳大于Km在1∶1时形成的自微乳区域。

图1 不同处方比例的伪三元相图

2.3考察指标 经单因素考察，对粒径、Zeta电位、多分散性指数(PDI)和饱和载药量进行预实验。单因素实验结果表明，不同水平时，Zeta电位差异较小，粒径、PDI、饱和载药量各水平之间差异较显著。故选择粒径、PDI、饱和载药量为Box-Behnken效应面法优化处方的考察指标。

2.3.1粒径(Y1)与PDI(Y2)的测定 取2.1项下制备的穿心莲内酯自微乳适量，用50倍量的纯水稀释，搅拌分散均匀，采用激光粒度仪分别测定粒径与PDI。

2.3.2饱和载药量(Y3) 取2.1项下制备的穿心莲内酯自微乳适量，加入过量穿心莲内酯原料药，密封超声30 min后在37 ℃水浴中振荡24 h，以4 000 r·min-1离心15 min，取上清液并稀释，用高效液相色谱(HPLC)法测定穿心莲内酯的含量，即饱和载药量。

2.4Box-Behnken优化自微乳处方

2.4.1Box-Behnken 以乳化剂聚乙二醇硬脂酸酯的含量(A)、助乳化剂二乙二醇单乙基醚的含量(B)和油相聚乙二醇甘油酯的含量(C)为自变量，各因素设置三水平，用-1、0、+1表示，因素及水平见表1；以粒径(Y1)、PDI(Y2)、饱和载药量(Y3)为考察指标，采用Design-Expert 8.06软件进行三因素、三水平设计， 每个水平平行测定3次，求平均值，实验设计与结果见表2。

表1 因素与水平

表2 实验设计及结果

2.4.2模型拟合 采用Design-Expert 8.06，以粒径、PDI、饱和载药量3个评价指标，对乳化剂、助乳化剂和油相3个因素进行二项式拟合，方程拟合为：

Y1=20.92-0.48A-0.72B+1.79C+0.60AB-0.083AC+2.97BC-3.59A2+3.08B2+2.60C2(P=0.004 4，r1=0.919 3)

Y2=0.16+0.058A+0.033B-0.019C+0.10AB+0.021AC+9.97×10-3BC-0.015A2+0.035B2-0.029C2(P<0.000 1，r2=0.982 4)

Y3=15.19-1.82A-0.43B+0.084C-0.42AB+1.69AC-0.42BC-1.36A2+0.79B2-0.58C2(P=0.001 2，r3=0.945 2)

由上述结果可知，评价指标Y1、Y2、Y3的r值均大于0.90，显著水平P值均小于0.01，说明拟合良好，差异具有高度显著统计学意义[19]。对该模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，所建模型经检验具有极显著统计学意义(P<0.001)，说明模型与实际情况吻合良好；模型失拟项检验无显著性(P=0.653 9)，说明未知因素对模型拟合结果干扰小，模型误差较小[20]。

表3 方差分析结果

2.4.3效应面优化与预测 采用Design-Expert 8.06软件绘制三维效应面图，见图2。各处方乳化后粒径均小于40 nm，且处方加水后均能形成澄清透明、淡蓝色乳光的溶液，说明各处方乳化剂、助乳化剂和油相的选择种类合适，比例适当。

由图2可知，随着Km值的增大，粒径先增大后减小，PDI增大，饱和载药量减小，由此可知，Km值是影响自微乳的重要因素。自微乳处方优化的原则是粒径小(稳定性高且容易吸收)、PDI小(粒径均一)、饱和载药量大，结合图1Km值在1∶1、3∶2、2∶1范围变化时，可以形成澄清透明、淡蓝色乳光的自微乳溶液，综合考虑Km值确定为1∶1，通过Design-Expert 8.06软件进行分析，最终得出的最优处方为：乳化剂聚乙二醇硬脂酸酯与助乳化剂二乙二醇单乙基醚Km为1∶1，乳化剂和助乳化剂总量与油相聚乙二醇甘油酯的比例为9∶1。

图2 3个因素对粒径、PDI、饱和载药量的三维效应面影响

2.4.4处方预测及验证实验 根据最优处方比例，按照2.1项下方法制备3批样品，观察外观并将实测值与预测值进行相关性分析，结果见表4。测定制备的自微乳溶液Zeta电位，考察是否稳定。见图3。

图3 自微乳的粒径分布、PDI和电位

表4 Box-Behnken效应面法优化处方再验证

观察3批自微乳外观，均呈澄清透明、淡蓝色乳光的溶液。通过比较实测值与预测值，粒径、PDI和饱和载药量的偏差小于7.0%，说明建立的数学模型预测效果良好，测得自微乳粒径为39.04 nm，PDI为0.15，Zeta电位为-29.80 mV，说明稳定性好。

2.5自微乳制备工艺考察

2.5.1混合方法选择 分别对3种常用的混合方法：涡旋振荡、超声混合、磁力搅拌进行考察，实验中发现超声混合时间较长且不宜混匀；涡旋振荡时间较短但适合制备少量样品；而磁力搅拌可以满足大量样品制备的要求，混合充分且时间短。

2.5.2搅拌速度考察 取优化的穿心莲内酯自微乳溶液适量，37 ℃下以低速、中速和快速分别磁力搅拌10 min，测定乳化时间，低速、中速、快速搅拌自乳化时间分别为(78±8)、(59±5)、(47±4) s。虽然乳化时间越短越好，但是通过测定3种速度制备的自微乳粒径，发现快速搅拌制备的自微乳粒径不均一，因此选择中速搅拌。

2.5.3搅拌时间考察 取优化的穿心莲内酯自微乳溶液适量，37 ℃下中速磁力搅拌10、20、30 min，测定粒径大小分别为(38.58±0.73)、(36.25±0.21)、(38.01±1.45) nm。时间大于10 min时，粒径大小变化较小，10 min时粒径大小均一且较小，故确定搅拌时间为10 min最佳。

综上所述，最终确定的自微乳制备工艺为:按处方比例称取穿心莲内酯、油相、乳化剂和助乳化剂，在(37±1) ℃下，将含药的油相缓慢加入混匀的混合乳化剂中，中速磁力搅拌10 min至澄清透明，即得澄清透明的穿心莲内酯自微乳。

3 讨论

本实验通过伪三元相图确定能形成自微乳的乳化剂和助乳化剂比例，在5个比例中，Km在1∶2、2∶3范围变化时，缓慢加水后形成淡蓝色乳光的半浑浊溶液；Km在1∶1、3∶2、2∶1范围变化时，缓慢加水后可形成淡蓝色乳光的澄清透明溶液，且Km越大，形成的自微乳区域越大，为Box-Behnken效应面法优化自微乳处方提供乳化剂与助乳化剂的比例范围。

由图2可知，当乳化剂用量不变时，随着油相用量的增大，粒径增大，饱和载药量增大；当助乳化剂用量不变时，随着油相用量的增大，粒径增大，饱和载药量先增大后减小(但变化趋势不明显)。由此可知，油相的用量对粒径及饱和载药量的影响较大，油相用量减小有助于减小粒径，但可能会引起饱和载药量的降低，所以通过Box-Behnken效应面法优化穿心莲内酯自微乳处方，根据该方法建立的数学模型描绘效应面图，充分考虑了乳化剂、助乳化剂、油相三因素之间的交互作用，从而方便、直观、科学地确定最佳处方为：聚乙二醇硬脂酸酯为乳化剂，二乙二醇单乙基醚为助乳化剂，油酸聚乙二醇甘油酯为油相，Km为1∶1，乳化剂和助乳化剂总量与油相的比例为9∶1，穿心莲内酯15.87 mg。通过验证，预测性良好。

在Box-Behnken效应面法优化处方再验证实验中，PDI的偏差比较大，为6.25%，是因为PDI本身较小，实验中发现一般小于0.4，所以容易在实验或验证处方的过程中出现偏差，可以考虑在后续的自微乳处方筛选中舍弃该指标，以实现量产的目标。

综合伪三元相图法、Box-Behnken效应面法及制备工艺考察，最终确定了穿心莲内酯自微乳的制备方法，通过平行样品的外观、粒径、Zeta电位和PDI等考察，表明制备方法稳定、可靠、便捷，但其体内释药行为有待进一步研究。