黄芩苷β-环糊精包合物脂质体的制备与药动学研究

余 清

(湖北六七二中西医结合骨科医院药学部，武汉 430070)

黄芩苷是从唇形科植物黄芩(Scutellariaba-icalensisGeorgi)的干燥根茎中提取分离出的黄酮类化合物，具有调节免疫功能、抗炎、抗病毒等药理作用[1]。已有文献表明，黄芩苷对乙肝的3种抗原具有明显抑制作用，对慢性乙肝并发症也具有良好的治疗效果[2-3]，主治急慢性肝炎，疗效确切[4]。黄芩苷水溶性差，生物利用度低，限制了其临床应用[5]。为了提高黄芩苷的溶解性，增加其口服生物利用度，研究人员已将其制备成固体脂质纳米粒[6]、纳米晶[7]、固体分散体[8]及磷脂复合物[9]等新型给药系统。β-环糊精(β-CD)包合物[10]已在提高难溶性药物的水溶性、改善药物生物利用度及增加药物稳定性等方面得到了广泛关注，其脂质体具有控制药物释放、延长药物半衰期、提高药物生物利用度等优势[11]。因此，本研究拟将黄芩苷首先制备成β-CD包合物，再包载到脂质体中，制备成β-CD包合物脂质体载药系统，并通过大鼠口服考察其生物利用度情况，为黄芩苷的口服新剂型研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 U3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；BXXW-LGJ-10型真空冷冻干燥机(北京市博翔兴旺科技发展有限公司)；Nicolet 380型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，美国Nicolet公司)；Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪(英国马尔文仪器有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JEM-2100F型透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

1.2试药 黄芩苷(四川省玉鑫药业有限公司，质量分数为95.60%，批号190806)；黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数≥98.00%，批号110715-201312)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数≥98.00%，批号100080-201406)；大豆卵磷脂(SPC，沈阳天峰生物制药有限公司)；胆固醇(安徽酷尔生物工程有限公司)；乙酸乙酯和β-CD(分析纯)，均购自国药集团化学试剂有限公司)；磷钨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；pH 6.8磷酸盐缓冲液(PBS，自制)；甲醇和乙腈(色谱纯，Fisher公司)；氯仿(北京化工厂)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1黄芩苷β-CD包合物的制备及包合率测定 采用饱和水溶液法制备黄芩苷β-CD包合物[12-13]，称取处方量β-CD加入到一定温度水中搅拌溶解，制成β-CD饱和溶液；称取处方量黄芩苷乙醇溶液缓慢滴加到β-CD饱和溶液中，恒温水浴并持续搅拌1 h，冷却到室温，置于冰箱中冷藏一昼夜，沙漏抽滤，无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥去除水分，即得黄芩苷β-CD包合物。

精密称取黄芩苷β-CD包合物1.0 g，加入到乙醇中超声15 min，加乙醇定容至20 mL，离心，移取全部上清液，减压干燥，残留物用甲醇10 mL溶解，过0.22 μm微孔滤膜，进样检测药物含量，计算包合率。

2.2正交实验法优化黄芩苷β-CD包合物制备工艺 选取对黄芩苷β-CD包合物制备工艺影响较大的3个因素，即搅拌速度、水浴温度以及药物与载体质量比，每个因素设置3个水平，以包合率作为考察指标，采用L9(34)正交实验筛选出最佳制备工艺[14]，正交实验的各因素与水平见表1，实验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交实验设计与结果

由表2和表3可知，对黄芩苷β-CD包合物的包合率影响顺序大小依次为C(药物与载体质量比)>A(搅拌速度)>B(水浴温度)。方差分析结果显示，药物与载体质量比与搅拌速度对包合率具有显著影响(P<0.05)，水浴温度影响不显著(P>0.05)。根据直观分析结果，确定黄芩苷β-CD包合物在制备过程中搅拌速度为120 r·min-1，水浴温度为55 ℃，药物与载体质量比为1∶3。

2.3黄芩苷β-CD包合物的验证 按照质量比为1∶3称取黄芩苷和β-CD，混合研磨后过80目筛，制备黄芩苷β-CD物理混合物。分别取黄芩苷、β-CD、黄芩苷与β-CD物理混合物以及黄芩苷β-CD包合物，采用FTIR进行光谱分析。测定条件：扫描范围为2 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为1次，实验结果见图1。

图1 黄芩苷β-CD包合物的红外光谱

β-CD和黄芩苷红外光谱图中可找到物理混合物的所有特征峰，说明物理混合物中β-CD与黄芩苷并未发生相互作用。相比于黄芩苷红外光谱图，黄芩苷β-CD包合物红外光谱图中1 500～1 700 cm-1范围的苯环特征峰、1 220～1 300 cm-1范围的苯环C=C伸缩振动的特征峰、1 000～1 100 cm-1范围的苯环呼吸振动峰和 C-O-C 伸缩振动的特征峰发生位移且峰强度明显减弱，表明黄芩苷与β-CD不是简单的物理混合，而是发生了明显的相互作用，证明包合物已经形成。

2.4黄芩苷β-CD包合物脂质体的制备 本研究采用薄膜-超声分散法[15]制备黄芩苷β-CD包合物脂质体。按处方量称取大豆卵磷脂、胆固醇和油酸，加入适量的氯仿溶解，移至茄形瓶中，固定到旋转蒸发仪上，在65 ℃水浴温度中旋转蒸发除去氯仿溶剂，在瓶内壁最终形成均匀的半透明状薄膜。向茄形瓶中加入一定量的黄芩苷β-CD包合物水溶液，充分振摇，在50 ℃水浴条件下继续旋转水化薄膜，直至全部洗脱，得到黄芩苷β-CD包合物初悬液，水浴超声0.5 h，依次经0.22、0.10 μm微孔滤膜挤出，即得黄芩苷β-CD包合物脂质体。

2.5黄芩苷β-CD包合物脂质体的性质研究

2.5.1粒径分布及Zeta电位测定 采用Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪测定黄芩苷β-CD包合物脂质体的平均粒径和Zeta电位。取适量黄芩苷β-CD包合物脂质体样品溶液，加入超纯水稀释后放入样品池测定粒径，另取黄芩苷β-CD包合物脂质体样品用超纯水稀释200倍后放入样品池测定Zeta电位，每份样品重复测定3次，取平均值。见图2和图3。

由图2和图3可知，黄芩苷β-CD包合物脂质体呈单峰分布，平均粒径为(90.82±4.59) nm(n=3)，多分散性指数(PDI)为(0.212±0.007)(n=3)，说明黄芩苷β-CD包合物脂质体的粒径分布均匀；Zeta电位为(-41.8±1.9) mV(n=3)，说明黄芩苷β-CD包合物脂质体表面带负电荷，电荷绝对值大于30 mV，说明粒子间存在较强的静电排斥力，有利于黄芩苷β-CD包合物脂质体的稳定性。

图2 黄芩苷β-CD包合物脂质体的粒径分布

图3 黄芩苷β-CD包合物脂质体的Zeta电位分布

2.5.2透射电镜观察 取上述最佳工艺制备的黄芩苷β-CD包合物脂质体适量，滴到300目铜网格上，静置2 min，用滤纸除去表面水分，晾干，滴加20 mg·mL-1磷钨酸负染色10 min，晾干后用透射电子显微镜观察黄芩苷β-CD包合物脂质体的形态和大小，结果见图4。

图4 黄芩苷β-CD包合物脂质体的透射电镜图

由图4可知，黄芩苷β-CD包合物脂质体粒径相对均一，外观圆整，无黏连，粒径大部分在100 nm左右，说明本研究制备的黄芩苷β-CD包合物脂质体质量较好。

2.6体外药物释放研究 采用透析袋扩散法考察黄芩苷β-CD包合物脂质体在不同pH值介质中的体外药物释放特性，将黄芩苷1.5 mg溶于无水乙醇中作为对照组，取黄芩苷β-CD包合物溶液以及黄芩苷β-CD包合物脂质体溶液作为实验组(黄芩苷含量与对照组相同)。将对照组和实验组样品分别置于透析袋中，扎紧两端，置于释放介质50 mL中，0～2 h释放介质为pH1.2盐酸溶液(SDS质量浓度为3.5 mg·mL-1)，2～12 h释放介质为pH6.8 PBS(SDS质量浓度为3.5 mg·mL-1)，于37 ℃恒温摇床上以100 r·min-1匀速振摇，于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取释放介质1 mL，并补充等量释放介质，释放介质经0.22 μm滤膜过滤，续滤液采用HPLC法测定药物含量，并计算累积释放度，绘制释放度-时间曲线，见图5。

图5 释放度-时间曲线 (n=6)

由图5可知，黄芩苷与黄芩苷β-CD包合物在2 h内基本释放完全，而黄芩苷β-CD包合物脂质体在12 h释放度为82.3%，表明黄芩苷β-CD包合物脂质体具有良好的缓释性能。

2.7体内药动学研究

2.7.1色谱条件 迪马C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(含甲酸质量浓度为1 mg·mL-1)，梯度洗脱程序见表4，检测波长为280 nm，流速为1 mL·min-1，柱温为33 ℃，进样量为10 μL。

表4 洗脱条件

2.7.2血浆中药物的提取与处理 取待测大鼠血浆100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入质量浓度为10 mg·mL-1的黄芩苷溶液10 μL以及内标溶液，涡旋60 s，加入适量乙酸乙酯进行萃取，涡旋5 min，以3 500 r·min-1离心15 min，吸取900 μL上清液，置于1.5 mL EP管中，37 ℃条件下氮气吹干，残余物用100 μL甲醇复溶，涡旋5 min，以15 000 r·min-1离心15 min，取上清液20 μL进样分析。黄芩苷含量按照2.7.1项下色谱条件进样测定，记录黄芩苷峰面积(As)和内标峰面积(Ai)，计算As与Ai的比值，根据标准曲线计算血药质量浓度。

2.7.3标准曲线的建立 向不同质量浓度的黄芩苷标准溶液中分别加入0.2 mL大鼠空白血浆，制备成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的血浆样品。血浆样品按照2.7.2项下方法处理，药物质量浓度按照2.7.1项下色谱条件测定。记录黄芩苷峰面积(As)和内标峰面积(Ai)，计算As与Ai的比值，以药物质量浓度(C)与该比值作线性回归，得回归方程为：As/Ai=275.31C-0.123(r=0.996 3)。

2.7.4精密度和提取回收率测定 取大鼠空白血浆200 μL，配制黄芩苷低、中、高3个质量浓度的血浆样品，血浆样品按照2.7.2项下方法处理，考察方法精密度及提取回收率情况。结果显示，血浆样品测定方法精密度RSD≤5.9%，低、中、高3个质量浓度血浆样品中黄芩苷的绝对回收率在84.9%～94.1%之间，符合生物样品分析方法指导原则的有关规定，该方法可用于大鼠血浆中黄芩苷的含量测定。

2.7.5动物分组及给药 取禁食12 h的Wistar大鼠，随机分为A、B组，每组6只，其中A组作为实验组，口服黄芩苷β-CD包合物脂质体样品3 mL，B组作为对照组，口服黄芩苷混悬液1 mL。给药后每组分别在 0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血，所得血样置于肝素浸润过的离心管中，以4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，-20 ℃保存，备用。血浆样品按照2.7.2项下方法处理，血药质量浓度按照2.7.1项下色谱条件进行测定，计算样品中黄芩苷的质量浓度。

血药质量浓度数据采用DAS 2.0 (Drug And Statistics for Windows)软件进行拟合分析，根据赤池信息判据最小原则(AIC)确定最佳药代动力学模型，并求得以下主要药代动力学参数：血浆药物消除半衰期(t1/2)、消除速率常数(Ke)、表观分布容积(Vd)、血浆清除率(CL)、0～t时间点的药-时曲线下面积(AUC(0～t))、0～∞时间点的药-时曲线下面积(AUC(0～∞))、吸收速率常数(Ka)、血药达峰质量浓度(Cmax)、血药达峰时间(tmax)，结果见表5。计算各时间点黄芩苷的血药质量浓度，绘制血药质量浓度-时间曲线，见图6。

表5 给药后黄芩苷主要药代动力学参数 (n=6)

图6 黄芩苷的血药质量浓度-时间曲线 (n=6)

由表5可知，采用DAS 2.0软件进行拟合分析，根据AIC值最小原则确定黄芩苷符合权重因子为1的一室模型。以黄芩苷成分为考察指标，相比于黄芩苷混悬液，黄芩苷β-CD包合物脂质体的t1/2明显延长，其中t1/2、Cmax和AUC(0～∞)分别为黄芩苷混悬液的2.16、0.78、2.15倍。

根据表5AUC数据计算黄芩苷β-CD包合物脂质体对相同剂量的黄芩苷混悬液的相对生物利用度(Fr)，Fr=AUC自制制剂÷AUC参比制剂×100%。

将黄芩苷β-CD包合物脂质体和黄芩苷混悬液的AUC(0～t)代入公式计算Fr：Fr=14.077÷7.635×100%=1.844%，表明将黄芩苷制备成β-CD包合物脂质体后与混悬液相比，生物利用度有了较大的提高。

3 讨论

黄芩是一种具有良好保肝护肝作用的中药[16]，其主要活性成分黄芩苷也被证明对乙肝以及乙肝并发症具有确切疗效[17-18]。但黄芩苷水溶性差、生物利用度低，限制了其临床应用。因此采用制剂手段提高黄芩苷的生物利用度对黄芩苷的临床应用具有重要意义[19-20]。

本研究采用饱和水溶液法制备黄芩苷β-CD包合物脂质体，正交实验结果表明，黄芩苷β-CD包合物的最佳工艺处方为：搅拌速度为120 r·min-1，水浴温度为55 ℃，药物与载体质量比为1∶3。采用薄膜-超声分散法制备黄芩苷β-CD包合物脂质体，平均粒径为(90.82±4.59) nm，Zeta电位为(-41.8±1.9) mV。体外溶出实验结果表明，黄芩苷β-CD包合物脂质体具有明显的缓释作用。大鼠体内药代动力学研究结果显示，黄芩苷β-CD包合物脂质体在大鼠体内的AUC(0～∞)增加，Cmax降低，t1/2延长，分别为黄芩苷混悬液的2.15、0.78、2.16倍，说明将黄芩苷制备成β-CD包合物脂质体后可提高黄芩苷的生物利用度，延长其半衰期。

综上所述，本研究制备的黄芩苷β-CD包合物脂质体具有良好的缓释效果，且明显提高了黄芩苷的生物利用度，说明本研究所用剂型提高了黄芩苷的临床应用价值，也对黄芩苷新剂型的开发奠定了坚实的基础。