阿立哌唑混合纳米胶束的制备与评价

巨鲜婷，果秋婷

(咸阳职业技术学院，咸阳 712000)

阿立哌唑(ARP)属于一种新型的非典型抗精神分裂症药物，主治各类型的精神分裂症[1-2]。ARP为生物药剂学分类系统(BCS)Ⅱ类药物，水溶性较差，不利于药物溶解吸收[3]，ARP具有肝脏首过效应，且是P糖蛋白(P-gp)的底物，不利于药物吸收[4]，这些不利因素最终导致其口服生物利用度较差[5]。为此，本研究以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F123)和D-α-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作为载体材料，将ARP制备成混合纳米胶束(ARP-mNMs)，并通过Caco-2细胞单层模型评价其体外渗透性，通过大鼠体内药动学评估药物生物利用度，为ARP的口服新剂型研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-100 型高效液相色谱系统(上海伍丰科学仪器有限公司)；5F-101S型系列集热式恒温磁力搅拌器(常州德普纺织科技有限公司)；LFD系列实验室冷冻干燥机(上海田枫实业有限公司)；Zetasizer Nano ZSE型纳米粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)；JEM-3200FS型场发射透射电子显微镜(日本电子株式会社)；QP-80型二氧化碳培养箱(济南欧莱博科学仪器有限公司)；F98型荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)。

1.2试药 阿立哌唑原料药(江苏恩华药业股份有限公司，质量分数为99.6%，批号191201)；阿立哌唑对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数为99.8%，批号100776-202003)；地西泮(华中药业股份有限公司)；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F123，上海经科化学科技有限公司)；D-α-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，上海起发实验试剂有限公司)；叔丁醇(罗辅医药科技有限公司)；Eagle′s培养基(西宝生物科技股份有限公司)；磷钨酸(西格玛奥德里奇贸易有限公司)；pH 6.8磷酸盐缓冲液(PBS，实验室自制)；胰蛋白酶-EDTA和汉克平衡盐溶液(HBSS)，均购自赛默飞世尔科技有限公司。

2 方法与结果

2.1ARP-mNMs的制备 通过冷冻干燥-水化法[6]制备ARP-mNMs。称取不同比例的Pluronic F123和TPGS共10 g和ARP 500 mg，加入到叔丁醇100 mL中，在60 ℃热水浴中搅拌溶解，将溶液分装到表面皿中，放入到冷冻干燥机中进行冷冻干燥，预冻温度为-35 ℃，预冻时间为2 h，一次干燥温度为0 ℃，干燥时间为10 h，二次干燥温度为30 ℃，干燥时间为6 h。干燥结束后取出样品，收集到西林瓶中，密闭保存；取上述冷冻干燥粉末1 g，置于锥形瓶中，加入60 ℃的蒸馏水10 mL(并保持在60 ℃水浴中)，在1 000 r·min-1磁力搅拌下水化含药粉末，持续搅拌30 min，将溶液冷却至室温，再将样品溶液转移至高速离心机中，以5 000 r·min-1离心1 h，除去不溶性药物及聚合物沉淀物，用0.22 μm微孔滤膜过滤上述溶液，即得到ARP-mNMs，低温冷藏，备用。

2.2ARP-mNMs的处方筛选

2.2.1临界胶束质量浓度(CMC)测定 CMC是用于评价聚合物形成胶束性能的重要参数，只有具备较低CMC的聚合物，其形成的胶束进入体内后才能避免被体液稀释而破坏其完整性[7]。本研究采用芘荧光光谱法测定不同比例Pluronic F123和TPGS形成的混合纳米胶束的CMC值[8]，结果见表1。方法：配制含芘的丙酮溶液，浓度为5×10-6mol·L-1，精密移取芘溶液0.1 mL，置于10 mL干燥的棕色量瓶中，氮气下吹干丙酮溶剂，平行制备样品6份，备用；另按照表1中Pluronic F123和TPGS的比例配制一系列浓度的聚合物溶液，加入到含芘的量瓶中，定容，在37 ℃恒温水浴中振荡48 h后，取样品溶液在荧光光度计下扫描，计算各样品溶液在373(I373)、384 nm(I384)处的荧光强度之比(I373/I384)，以荧光强度比(I373/I384)与聚合物浓度对数值(lgC)作图，其交叉点即为不同比例Pluronic F123和TPGS形成的胶束的CMC值。

形成的胶束CMC值越低，其进入体内的抗稀释能力越强，由表1可知，单独TPGS的CMC值为0.226 mg·mL-1，单独Pluronic F123的CMC值为0.002 mg·mL-1，随着处方中Pluronic F123的比例增加，其形成的CMC值呈降低趋势。

2.2.2ARP-mNMs制剂性质研究 按照2.1项下方法以不同配比Pluronic F123和TPGS制备ARP-mNMs，通过测定粒径分布、Zeta电位和包封率，比较其制剂性质，结果见表2。

表2 不同配比Pluronic F123和TPGS对形成的ARP-mNMs性质的影响

由表2可知，单独以TPGS制备的ARP-mNMs粒径较大，为(216.2±7.7) nm，而单独以Pluronic F123制备的ARP-mNMs粒径较小，为(62.4±1.7) nm，即CMC越大，其形成的胶束所需要的聚合物浓度越高，因此形成的粒径越大[8]。而不同配比Pluronic F123和TPGS制备的ARP-mNMs，随着处方中Pluronic F123用量的增加，粒径逐渐减小。

2.2.3ARP-mNMs的处方确定 本研究要求制备的ARP-mNMs一方面具有较低的CMC值，确保其进入体内仍以完整胶束存在，同时具有较小的粒径分布，利于提高其对胃肠道细胞膜的渗透性；另一方面处方中需要存在一定量的TPGS，用以克服P-gp对药物的外排作用。因此本研究根据研究结果确定Pluronic F123和TPGS的配比为50∶10。

2.3微观结构观察 在透射电子显微镜下观察ARP-mNMs的微观形态。取ARP-mNMs样品滴加到涂有碳的铜网上，再滴加20 g·L-1的磷钨酸溶液染色30 s，风干液体后，在透射电镜下观察(加速电压为150 kV)并拍摄电镜照片。见图1。由图1可知，ARP-mNMs呈球状，大小分布均匀，未发现任何聚集现象。见图1。

图1 ARP-mNMs的透射电镜照片

2.4体外药物释放研究 使用透析袋扩散法[9]评价ARP-mNMs的体外药物释放情况。取ARP-mNMs及ARP乙醇溶液(取ARP原料药50 mg溶解到10 mL乙醇溶液中，即得)各2 mL，分别置于透析袋中，系紧两端，将透析袋浸入到37 ℃、pH 值为6.8的PBS(吐温-80质量浓度为5 mg·mL-1)中，介质体积为200 mL，磁力搅拌子转速为100 r·min-1，在固定的时间间隔(0.5、1、2、4、6、8、10、12 h)内取出3 mL释放介质(同时补加同温同体积空白介质)，过滤，进样检测药物含量，计算药物质量浓度，绘制药物累积释放度-时间曲线，见图2。

图2 ARP-mNMs的体外药物释放曲线

由图2可知，ARP乙醇溶液中的药物在2 h内释放完全，而ARP-mNMs在释药前期表现为突释现象，在前2 h药物释放度约为37%，而在随后的时间内表现为持续缓慢释药现象，在12 h约为85%。

2.5稳定性研究 将ARP-mNMs分装到西林瓶中，密封，置于(25±2) ℃环境中，分别于10、20、30 d取样，观察外观，并测定粒径分布、Zeta电位和包封率，结果见表3。

由表3可知，ARP-mNMs在(25±2) ℃环境中放置30 d，其外观仍为淡蓝色透明状溶液，未观察到溶液出现絮凝现象以及药物沉淀，粒径、Zeta电位以及包封率均未发生显著变化，说明ARP-mNMs存放在(25±2) ℃环境中的稳定性良好。

表3 稳定性实验结果

2.6ARP-mNMs抗稀释性能研究 ARP-mNMs经口服给药进入体内，体液会对其产生稀释作用，有可能破坏胶束的完整性，导致药物泄露，因此通过测定稀释后ARP-mNMs的粒径分布，评估其抗稀释能力。取ARP-mNMs加入蒸馏水，分别稀释10、50、100和200倍，静置0.5 h后测定粒径分布，并与未稀释ARP-mNMs进行比较，结果见图3。

由图3可知，ARP-mNMs稀释不同倍数后，其粒径分布与PDI较为稳定，无明显变化，推测ARP-mNMs经口服给药进入体内胶束结构不会遭到破坏。

图3 ARP-mNMs稀释后的粒径分布与

2.7细胞转运研究 取Caco-2细胞在Eagle′s培养基(含有胎牛血清质量浓度为100 mg·mL-1，L-谷氨酰胺质量浓度为10 mg·mL-1和青霉素-链霉素质量浓度为10 mg·mL-1)中传代培养，培养箱温度为37 ℃，相对湿度为90%，CO2体积分数为5%，培养7 d后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA溶液消化并离心，并以5×104个细胞·cm-2的密度接种在Millicell插入式细胞培养皿(面积为0.6 cm2)中，加入培养基孵育，每隔2 d更换1次培养基，孵育14 d，形成Caco-2单层细胞。在转运实验前测定得Caco-2单层细胞的顶端(AP)和基底外侧(BL)的跨上皮电阻值(TEER)均大于600 Ω·cm-2，说明单层细胞足够紧密，可用于细胞转运实验[10]。使用pH值为 7.4的HBSS孵育Caco-2单层细胞15 min，再分别取含有ARP原料药和ARP-mNMs的HBSS，放入到Caco-2单层细胞的AP侧(0.4 mL)或BL侧(0.6 mL)作为供试液，并在BL侧或AP侧加入相同体积的空白HBSS，将单层细胞在37 ℃下孵育，并在15、30、45、60、90、120 min从接收侧取接收液(同时补加同体积空白HBSS)，离心后经HPLC法测定药物含量，以评价ARP原料药和ARP-mNMs的吸收过程(AP→BL)和分泌过程(BL→AP)的特性，并按照公式(1)和(2)计算表观渗透系数(Papp)和外排比(ER)：

Papp=(dQ÷dt)÷(A×C0)

(1)

ER=Papp(BL→AP)÷Papp(AP→BL)

(2)

其中，dQ÷dt是接收液中ARP的稳态透过率，C0是供试液中ARP的初始浓度，A是Caco-2单层细胞面积，Papp(AP→BL)是ARP从顶端转运到基底外侧的Papp值，Papp(BL→AP)是ARP从基底外侧转运到顶端的Papp值。结果见表4。

表4 ARP原料药和ARP-mNMs在Caco-2细胞单层中的渗透性

由表4可知，ARP原料药从Caco-2单层细胞的BL侧转运到AP侧，其Papp(BL→AP)值为(14.21±0.43)×10-6cm·s-1，而ARP原料药从Caco-2单层细胞的AP侧转运到BL侧，其Papp(AP→BL)值为(6.24±0.36)×10-6cm·s-1，ER值为2.28(>2)，说明ARP是P-gp底物[11]。将ARP制备成ARP-mNMs，其Papp(BL→AP)值由原来的(14.21±0.43)×10-6cm·s-1降低到(3.75±0.33)×10-6cm·s-1，下降近3.79倍，这是由于ARP-mNMs处方中加入TPGS，能够有效抑制P-gp的活性，降低了P-gp对ARP的外排作用；同样，ARP-mNMs的Papp(AP→BL)值由原来的(6.24±0.36)×10-6cm·s-1升高至(11.93±0.41)×10-6cm·s-1，提高了近1.91倍，说明ARP-mNMs通过细胞膜内吞作用进入细胞内，促进药物吸收。相比ARP原料药的ER值，ARP-mNMs的ER值降低了7.35倍，说明ARP-mNMs能够有效提高药物的渗透性。

2.8大鼠体内药代动力学

2.8.1色谱条件 色谱柱为CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.03 mol·L-1乙酸铵水溶液(70∶30)，检测波长为257 nm，柱温为30 ℃，流速为0.8 mL·min-1，进样量为20 μL。

2.8.2血浆样品前处理 取大鼠血浆0.2 mL，置于5 mL圆底离心管中，加入40 μL质量浓度为10 μg·mL-1的地西泮作为内标，涡旋混合，再加入乙酸乙酯与二氯甲烷的混合物(80∶20)1 mL，涡旋混合，离心，取上清液，置于3 mL尖底离心管中，氮气吹干，残渣用100 μL流动相复溶，离心，取上清液进样检测。

2.8.3标准曲线及方法学验证 精密称取ARP对照品25.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀释定容，摇匀，得ARP质量浓度为250 μg·mL-1的对照品储备液，取上述储备液依次配成质量浓度分别为2.5、6.25、12.5、25.0、62.5、125.0 μg·mL-1的ARP乙腈对照品溶液。取大鼠血浆0.2 mL，置于5 mL圆底离心管中，加入上述系列质量浓度的ARP乙腈对照品溶液及ARP对照品储备液各10 μL，涡旋混合，得到含有ARP质量浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg·mL-1的标准溶液，加入内标溶液40 μL，涡旋混合，再按照2.8.2项下血浆样品前处理进行操作，并进样检测，以ARP质量浓度(C)为横坐标，以ARP与内标的峰面积比值(As/Ai)为纵坐标，得到线性回归方程为：As/Ai=1.586C-0.264(r=0.999 7)，线性关系良好。

另配制含有ARP质量浓度分别为0.1、1.0、10.0 μg·mL-1的血浆样品，加入内标溶液，涡旋混合，低、中、高3种质量浓度样品重复制备6份。所有样品按照2.8.2项下血浆样品前处理进行操作，并进样检测，考察方法精密度和提取回收率。结果显示，低、中、高3种质量浓度样品的提取回收率分别为88.7%、94.3%、96.1%，精密度RSD值分别为8.7%、6.7%、7.1%，说明本方法提取回收率高，重复性好。

2.8.4动物实验 取SD大鼠12只，体质量为(200±20) g，雌雄各半，禁食不禁水12 h。将大鼠随机分为2组，第1组大鼠灌胃给予ARP混悬液(分散介质为5 mg·mL-1的羟丙甲基纤维素)，第2组大鼠灌胃给予ARP-mNMs，给药量均为20 mg·kg-1，并在0、0.5、1、2、3、4、6、8和12 h经眼眶后神经丛取血0.5 mL，离心，取大鼠血浆0.2 mL,置于5 mL圆底离心管中，加入内标溶液40 μL，涡旋混合，再按照2.8.2项下血浆样品前处理进行操作，并进样检测，WinNonlin软件计算药动学参数，见表5，并绘制血药质量浓度-时间曲线，见图4。

图4 血药质量浓度-时间曲线

表5 大鼠药动学参数

由表5可知，大鼠口服ARP混悬液后其Cmax和AUC(0～∞)分别为(1.37±0.48) μg·mL-1和(8.4±1.3) μg·mL-1·h，而大鼠口服ARP-mNMs后其Cmax和AUC(0～∞)分别为(5.67±1.04) μg·mL-1和(19.8±2.3) μg·mL-1·h，后者较前者的Cmax和AUC(0～∞)分别提高了4.14、2.36倍，说明ARP-mNMs可显著提高ARP的达峰质量浓度和口服生物利用度，这主要归因于ARP-mNMs的处方中加入了TPGS，可有效抑制肠上皮细胞膜中的P-gp活性，降低对ARP的外排作用。

3 讨论

为了改善ARP的溶解度及生物利用度，目前已将ARP制备成纳米混悬剂[12]、β-环糊精包合物[13]、固体脂质纳米粒[14]、聚合物胶束[15]等新型给药系统。由高分子聚合物和/或表面活性剂形成的胶束可增加药物的溶解度，在改善药物生物利用度方面显示出巨大潜力[16-17]。Pluronic F123是一种两亲性高分子聚合物，作为一种非离子型表面活性剂，可用于提高难溶性药物的溶解度[18]，已作为一种安全的药用辅料被多国药典收载； TPGS同样属于非离子表面活性剂，但TPGS能够抑制细胞膜内的P-gp活性，以降低其对底物的外排作用[19]。而以Pluronic F123和TPGS形成的混合纳米胶束能够显著改善难溶性药物的溶解度和口服生物利用度[20]，因此本研究以Pluronic F123和TPGS作为胶束载体，将ARP制备成ARP-mNMs。