日本沼虾染色体核型、基于3种同工酶的群体遗传结构分析

张林，周剑光，甘金华，张涛，何力

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心，湖北 武汉 430072)

日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又称青虾或河虾，隶属软甲纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)[1-2]。日本沼虾是中国重要的淡水经济食用虾，广泛分布于江河、湖泊、水库、池塘及沟渠中。因其含有丰富的蛋白质、营养价值高、生长快、适应性好、繁殖能力强而倍受青睐，养殖规模不断扩大。但野生群体因受自然和人为等因素的影响，产生栖息范围变小、种质资源减少、个体小型化和低龄化严重等问题[3]。开展日本沼虾染色体研究可为遗传改良及新品种培育提供基础资料。国内一些学者已应用 mtDNA D-Loop[2]、RAPD[4]、SSR[5]、ISSR[6]和COI[7]等技术对不同水域的日本沼虾野生群体进行了分析。同工酶是基因表达的直接产物，同工酶图谱在一定条件下较为稳定，可作为生化遗传标记物，用于生物种质鉴定、遗传多样性分析[8-10],然而关于日本沼虾同工酶遗传结构的分析却鲜有报道。

本研究对洪湖日本沼虾野生群体的染色体进行核型分析[11]，对肌肉进行同工酶电泳[12-14]分析，开展关于群体遗传结构[4,6,15-21]方面的研究，旨在完善中国日本沼虾野生群体的种质资源研究，为制定合理的育种方案提供数据参考。

1.1 材料来源

2018年8月和2019年10月，先后两次在湖北洪湖采捕虾样共40只，鉴定定种后，体重为(4.0±0.6)g，体长为(5.3±0.9)cm，充氧活体运回实验室，暂养于室内循环水虾池。试验用水连续充氧，水质良好。

1.2 染色体标本制作

染色体标本制备以雄虾精巢为材料，采用林义浩的体内注射法[22]，具体操作方法参考银鲳(Pampusargenteus)[23]。

1.3 染色体众数确定及组型分析

染色体众数及组型分析参照Tan等[24]的方法进行。具体操作方法参考银鲳[23]。

1.4 同工酶样本制备

将日本沼虾个体表面水分擦干，剥壳后立即解剖，取背部肌肉置于低温冰箱中(-20 ℃)保存备用。从冷冻的组织样品中取出0.3～0.4 g，剪碎，以1∶3的比例(重量/体积)加入蒸馏水，充分匀浆后，用高速冷冻离心机4 ℃ 12 000 rpm/min离心20 min，吸取上清液并转入新离心管中。重复2～3次，直至上清液澄清为止。整个过程均在低温下操作。

1.5 电泳

采用SDS-PAGE电泳。浓缩胶浓度为3.5%，分离胶浓度为7.0%。电泳缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸(TG)。每个胶孔加样20 μL；先用280 V电压进行电泳，使样品尽快进入凝胶孔，电泳15 min，调至220 V，正式电泳开始，于4 ℃下稳压进行，待溴酚蓝跑至胶块底部终止电泳。

1.6 染色和脱色

同工酶的染色参照王中仁[25]的方法。染色后的胶片放入2.5%冰乙酸中进行脱色。

1.7 图谱分析与数据处理

脱色后清晰显示的胶片，放入保存液中固定。固定好后，用水溶性透明玻璃纸将胶片包裹好，置于阴凉处晾干，制成干胶，利于长期保存。对已染色和固定的胶片，进行拍照并分析。据电泳结果判断每种同工酶的基因型，并依据基因型计算每个等位基因的基因频率，各参数计算参考文献[26]方法。

2 结果与分析

2.1 日本沼虾二倍体染色体数目

统计日本沼虾共100个有丝分裂中期相，结果如表1所示，其中染色体总数为104的分裂相细胞占71%，确定其为二倍体，染色体数目2N=104(图1a)。

图1 日本沼虾染色体中期分裂相及组型图a：日本沼虾染色体中期分裂相；b：日本沼虾染色体组型图Fig.1 Chromosme metaphase and group diagram of M.nipponensea：Metaphase of M. nipponensis chromosomes；b：Karyotype of M. nipponensis

表1 日本沼虾染色体数目的分布Tab.1 Distribution of chromosome numbers in M. nipponense

2.2 日本沼虾染色体组型

参考Tan等[24]的方法，测量10个日本沼虾染色体长臂与短臂长度，取平均值，计算相对长度、臂比及着丝粒指数，统计结果见表2。发现染色体可配成52对，按Levan命名法[27]分成3组，M组(中部着丝点染色体，r=1.00～1.71)74对，ST组(亚端部着丝点染色体r=3.01～7.00)4对；T组(端部着丝点染色体，r=7.01～∞)11对。按相对长度排列，制成组型图(图1b)，核型公式为2N=74M+8ST+22T，臂数NF=178。未发现带有特殊标志性特征如随体、次缢痕的染色体，也未发现与性别决定有关的异形性染色体。

表2 日本沼虾染色体核型数据Tab.2 Chromosome karyotype data of M. nipponense

2.3 日本沼虾肌肉组织同工酶表达的差异性

2.3.1 乳酸脱氢酶(LDH)

日本沼虾肌肉组织乳酸脱氢酶检测到3条酶带，存在着多态现象(图2)。同工酶条带在肌肉中的颜色均较深，表达活性均较强。

图2 日本沼虾肌肉组织LDH同工酶的电泳图谱1-10代表10个雄虾个体的肌肉；11-20代表10个雌虾肌肉个体。下同。Fig.2 LDH isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues1-10 represent the muscles of 10 male individual shrimp;11-20 represent the muscles of 10 female individual shrimp.The same below.

2.3.2 酯酶(EST)

日本沼虾肌肉组织酯酶表达结果如图3，共检测到3条酶带，EST3颜色最深，说明活性最强，其他2条带活性也较强，存在多态现象。

图3 日本沼虾肌肉组织EST同工酶的电泳图谱Fig.3 EST isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues

2.3.3 苹果酸脱氢酶(MDH)

日本沼虾肌肉组织苹果酸脱氢酶表达结果如图4，颜色较深，活性均较强，存在多态位点。

图4 日本沼虾MDH同工酶的电泳图谱Fig.4 MDH isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues

2.4 日本沼虾群体遗传结构

本研究通过分析20只日本沼虾(雌雄各10只)肌肉中3种同工酶谱带，初步对日本沼虾进行了群体遗传学研究(表3)。经统计共记录10个基因位点，其中3个基因位点有多态，多态位点的基因频率为0.35～0.65，多态位点比例P为30%；等位基因数为13，位点平均有效等位基因数(Ne)为1.3；平均观测杂合度(Ho)为0.22，平均期望杂合度(He)为0.141 5，Hardy-Weinberg遗传偏离指数D为0.554 8。

表3 日本沼虾群体的遗传学结构Tab.3 Genetic structures of M. Nipponense population

3 讨论

3.1 日本沼虾染色体核型分析

邱高峰等[11]曾报道日本沼虾的初级精母细胞减数分裂前期可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期5个时期，核型组成是N=52=37M+4ST+11T。本研究在显微镜下观察到清晰的精原细胞有丝分裂中期染色体和精母细胞减数分裂中期二价体分裂相，经过对染色体数目的统计分析，得到日本沼虾精母细胞减数分裂中期二价体数目(N=52)，精原细胞有丝分裂染色体数目(2N=104)。本试验总结出了相对准确的二价体核型公式2N=74M+8ST+22T，并提供了相应的染色体长短臂的具体数据，完善了日本沼虾染色体核型分析的信息。

3.2 日本沼虾同工酶表达的组织特异性分析

迄今为止，已发现并研究的同工酶多达几百种，常见的同工酶有肌酸激酶、乳酸脱氢酶、酯酶、苹果酸脱氢酶和超氧化物歧化酶等。本实验通过对日本沼虾肌肉组织的3种同工酶进行电泳分析，发现3种同工酶在肌肉中均高水平的表达，表达的谱带全面。3种酶在肌肉中的分布和活性与同工酶的功能密切相关。

在高等脊椎动物中，LDH为四聚体酶，通常有2或3个基因位点编码。本实验中确认有LDH-A和LDH-B2个基因编码3个同工酶位点，LDH1为多态，LDH2和 LDH3位点均为单态。A4基因编码的LDH1一般在无氧条件下起作用，揭示日本沼虾肌肉无氧代谢较为旺盛，与其底栖的居住与生活习性相适应；B4编码的LDH2在有氧组织中表现出很高的活性，说明日本沼虾的肌肉也参与催化乳酸氧化形成丙酮酸进入三羧酸循环，可能因为日本沼虾的肝脏系统不够发达。也间接证明了日本沼虾肌肉中不存在编码LDH-C多肽链的基因，表明日本沼虾在进化上处于低级阶段。这可能是因为沼虾属虾类在淡水环境中处于食物链底端，选择压力较大所致。

酯酶是催化酯类化合物水解的一类复杂的酶系，在酯代谢和生物膜的结构方面发挥重要作用，有明显的物种特异性,可为研究鱼、虾类之间分类地位和进化关系提供生化指标。鱼、虾类的EST一般是单体或二聚体酶，以单体为主。本实验中日本沼虾肌肉中EST有3个基因位点编码，在肌肉中的分布无性别差异，表达水平均较高，其中EST1、EST2为单态，EST3为多态。从EST同工酶图谱可以看出，EST在日本沼虾肌肉中成份很高，表达活性很强，可能与控制该组织酯酶的基因开启有关，说明其在肌肉中起着重要的生理作用。

甲壳类苹果酸脱氢酶(MDH)为二聚体酶，分为上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)，二者相互不形成异二聚体。一般有3个座位，通常显示出3条酶带。

已有报道表明，青虾MDH为7条带[28]，雌性青虾MDH为5条带[29]。本实验结果显示日本沼虾肌肉组织MDH由4个基因位点编码，表达水平均较高，其中MDH2表达水平最高，MDH1～MDH3为单态，MDH4为多态。同一物种的同一种同工酶，电泳结果常常各不相同，原因可能是电泳条件不同，也可能是由于物种个体发育阶段、生理状况和环境条件不同，或基因多态性造成。

3.3 日本沼虾群体的遗传学结构分析

认识一个种的群体遗传结构有助于理解该种群的进化过程，多态位点比例和平均杂合度是衡量虾类群体生化遗传变异和种质资源状况的重要参数，研究表明鱼类多态位点比例大致在11.8%～41.0%，而平均杂合度为0.042 0～0.151 3。对比以上数据，本研究中得到的P值为30%，平均杂合度He为0.141 5，处于较高水平，这表明日本沼虾野生群体的生化遗传变异在水生生物中也处于较高水平。遗传偏离指数(D)也能正确、全面地反映群体的遗传平衡状况。D值越接近零，基因分布就越接近平衡状态，D值的正负直接反映了种群内杂合子的过剩或缺失状态，D值大于0表明杂合子过剩，反之则表明杂合子缺失。本研究中日本沼虾群体的D值为0.554 8，表明其杂合子过剩，说明该群体遗传变异程度较大，遗传多样性较高。

日本沼虾群体的有效等位基因数Ne为1.3，硬骨鱼类的Ne为1.16～1.58，显示日本沼虾群体的遗传多样性处于中等水平。日本沼虾野生群体的遗传多样性维持以选择为主，同时受到漂变的选择压力。

通过以上研究可以看出，虽然取样的日本沼虾数量较少，但仍表现出杂合子过剩的情况，说明虽然未经人工定向改良，野生日本沼虾群体的种质资源库仍有较大的变异程度，从而可以为后续的人工育种提供良好的亲本。但值得注意的是，日本沼虾的有效等位基因数偏低，其原因可能是野生日本沼虾群体数量的下降或人为造成的地理隔离使日本沼虾种群成为了小种群。由于长江中下游大量的拦河坝已经建成，地理隔离难以避免，因此，保护野生日本沼虾种质资源已成为迫切需要。目前比较可行的手段有避免过度捕捞与环境污染，防止野生日本沼虾种群规模进一步缩小。建议采取人工放流等手段促进不同江段的野生日本沼虾种群进行基因交流，以保证日本沼虾的遗传多样性。