伊马替尼与金匮金肾气丸在人工胃/肠液中的相互作用研究

朱思晗， 常晓慧， 王玲玲， 李欣然， 陈晓霞*

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600；2.中国人民解放军联勤保障部队第967医院，辽宁大连 116021)

伊马替尼是一种有效的酪氨酸激酶选择性口服信号转导抑制剂[1]，可通过抑制 Bcr -Abl酪氨酸激酶，选择性抑制 Bcr -Abl 阳性细胞系细胞、急性淋巴细胞白血病患者的新鲜细胞的增殖并诱导其凋亡，用于治疗慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)[2]。该药物口服吸收好，绝对生物利用度超过97%[3]，使患者生存率得到大大提高。本课题组前期研究发现，长期服用伊马替尼可引起男性慢粒患者精子数量减少并出现畸形[4]。

金匮肾气丸出自《金匮要略》，是汉代医圣张仲景所创著名方剂，由附子、肉桂、熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻等组成。该方剂配伍严谨，疗效显著，被称为“补肾诸方之祖”，深受历代医家推崇，至今仍在临床上广泛应用[5]。金匮肾气丸可通过补肾阳作用，改善小鼠精子畸形率、活动度等[6]。但是中药成分复杂，与西药共同服用时，需要充分考虑药物间相互作用。有研究报道伊马替尼在体内经多种 CYP450 代谢酶和转运体作用，在合并用药过程中易发生药动学的相互作用[7 - 9]。本实验以体外模拟胃/肠液为环境，将伊马替尼与不同浓度金匮肾气丸共同作用不同时间，通过考察人工胃/肠液中伊马替尼及金匮肾气丸中主要化学成分，研究不同浓度金匮肾气丸与伊马替尼相互作用，为进一步体内分析及二者的合理用药奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

安捷伦1100高效液相色谱系统(美国，安捷伦)；BSA2224S分析天平(德国，赛多利斯)。

伊马替尼对照品(纯度99.3%，中国药品生物制药检定所)；莫诺苷、马钱苷、丹皮酚对照品(纯度均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司)；胃蛋白酶、胰酶均购自国药集团北京试剂有限公司；甲磺酸伊马替尼片(瑞士诺华制药公司)；乙腈(色谱纯，大连铭扬实验试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。娃哈哈纯净水。

金匮肾气丸(北京同仁堂制药有限公司)。

1.2 溶液的制备

对照品溶液制备：精密称取各对照品适量并溶于甲醇，分别配制成含伊马替尼、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚质量浓度为2.000 mg/mL的储备溶液。

空白基质制备：取胰蛋白酶或胃蛋白酶0.1 g，置于50 mL烧杯中，加入10 mL水充分溶解后，加热煮沸10 min，得到灭活的胰蛋白酶或胃蛋白酶溶液。将以上两种溶液混合后，加入34 mg KH2PO4，加水定容至25 mL 容量瓶中，即为空白基质溶液。取空白基质溶液1 mL，加入200 μL乙腈涡旋混匀1 min，4 ℃下以20 000 r/min离心10 min。

标准曲线绘制：分别取适量的各对照品储备液，以空白基质稀释至含伊马替尼、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚浓度分别为200、80、20、30 μg/mL混合标准溶液，依次稀释为4个梯度混合标品，按“1.3”色谱条件进样检测，记录峰面积。

人工胃液的制备：按文献方法[10]，取16.4 mL稀HCl，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，摇匀使其溶解，用0.1 moL/L HCl调pH至1.3，再加水稀释并定容至1 000 mL，即得人工胃液。

人工肠液的制备：按文献方法[10]，取6.8 g KH2PO4，加水500 mL，摇匀使其溶解，用0.1 moL/L NaOH溶液调节pH至6.8；另称取胰蛋白酶10 g，加适量水溶解；将上述两种溶液混合后，再加水稀释并定容至1 000 mL，即得人工肠液。

人工胃/肠液下伊马替尼样品配制：取伊马替尼原药粉末10.00 mg,加入人工胃/肠液50.00 mL，振荡混匀，37 ℃水浴孵育，分别在反应0、2、4、8、12 h时取反应液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈进行沉淀，然后在5 000 r/min离心10 min，取上清液，用微孔滤膜过滤，取续滤液进行色谱分析。

人工胃/肠液下金匮肾气丸样品配制：分别取金匮肾气丸大蜜丸粉末0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g，加入人工胃/肠液50.00 mL，振荡混匀，37 ℃水浴孵育，分别在反应0、2、4、8、12 h时取反应液1.0 mL，加入0.2 mL 乙腈进行沉淀，5 000 r/min离心10 min，取上清液用微孔滤膜过滤，取续滤液进行色谱分析。

人工胃/肠液下伊马替尼+不同浓度金匮肾气丸样品配制：取伊马替尼片、金匮肾气丸粉末适量，按伊马替尼片10.00 mg分别添加金匮肾气丸0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g的比例配制样品，分别加入人工胃/肠液50.00 mL，振荡混匀，37 ℃水浴孵育，分别在反应0、2、4、8、12 h时取反应液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈进行沉淀，以5 000 r/min离心10 min，取上清液，用微孔滤膜过滤，取续滤液进行色谱分析。

1.3 色谱条件

安捷伦ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)和0.3%H3PO4水溶液(B)。梯度洗脱(0～5 min，95%～92%B；5～20 min，92%B；20～35 min，92%～72%B；35～55 min，72%～40%B；55～60 min，40%B)；流速为1 mL/min；检测波长240 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法性能指标考察

2.1.1 线性范围及定量限考察将标准溶液在优化色谱条件下检测，以各对照品峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。表1列出了各化合物的线性回归方程、线性范围、相关系数(R)及定量限。

表1 化合物的线性方程、线性范围、相关系数(R)及定量限Table 1 Linear equantions,linear ranges, correlation coefficients(R) and limit of quantification(LOQ) of the determined compounds

2.1.2 仪器精密度考察取线性项下含伊马替尼浓度分别为12.50、50.00、200.00 μg/mL，3个浓度的混合标准溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录1 d内重复测定6次以及连续6 d测定谱图，各待测化合物的日内及日间精密度(RSD)均<2.0%。

2.1.3 方法准确度考察取伊马替尼原料药5 mg及金匮肾气丸样品1.8 g，分别加入(低、中、高)三个不同浓度的混合标准溶液，按照“1.2”人工胃液下伊马替尼+不同浓度金匮肾气丸样品配制方法处理后，各取10 μL注入液相色谱仪，计算回收率(表2)。

表2 回收率试验结果(n=5)Table 2 Results of recovery test(n=5)

2.2 伊马替尼与金匮肾气丸在人工胃/肠液中相互作用研究

分别取混合对照品溶液、人工胃液、人工肠液、人工胃/肠液下伊马替尼样品、人工胃/肠液下金匮肾气丸、人工胃/肠液下伊马替尼+金匮肾气丸样品各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，平行测定3次。由图1可见，人工胃/肠液对样品测定不存在干扰，混合标准品在各样品中分离度好，适用于伊马替尼与金匮肾气丸在人工胃/肠液中相互作用研究测定。

图1 4种标准品及测试样品的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms obtained for mixed standards and samplesA.Standards(1.Morroniside；2.Loganin；3.imatinib；4.Paenonl)；B.Simulated gastric fluid(SGF)；C.Simulated intestinal fluid(SIF)；D.Imatinib(IM) in SGF；E.Jingui shenqi Pill (JG,3.6 g)in SGF；F.IM+JG(3.6 g)in SGF；G.IM in SIF；H.JG (3.6 g)in SIF；I.IM+JG(3.6 g)in SIF.

由图2可知，10.00 mg 伊马替尼中加入不同量的金匮肾气丸后，人工胃/肠液中伊马替尼浓度随着金匮肾气丸加入量增加，当达到3.6 g时伊马替尼含量显著下降，与未加入金匮肾气丸相比P<0.01；但低浓度金匮肾气丸对其含量几乎没有影响(图2A)。

在人工胃/肠液中伊马替尼与不同浓度的金匮肾气丸共同孵育后，与金匮肾气丸单独孵育相比，丹皮酚含量几乎不受伊马替尼影响(图2D)。

不同浓度金匮肾气丸中马钱苷含量随伊马替尼加入降低，当金匮肾气丸量高于1.2 g时，马钱苷含量降低十分显著(图2C)。

人工胃液中莫诺苷不受伊马替尼影响；人工肠液中，金匮肾气丸量高于2.4 g时，莫诺苷含量降低(图2B)。

图2 人工胃/肠液中伊马替尼与不同浓度金匮肾气丸相互作用后主要成分浓度变化Fig.2 Concentration changes of main components after interaction between imatinib and Jingui shenqi Pill in SGF/ SIFNotes:A.in SGF，inner is in SIF；**P<0.01 indicates JG+IM showed statistically significant differences from IM with same concentration；#P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SGF；&P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SIF.

伊马替尼用于治疗对干扰素治疗失败的白血病患者，临床初期使用剂量为600 mg/d，稳定后持续服用推荐最佳使用剂量为400 mg/d。考虑临床实际情况，患者急变期以治疗为主，不适宜服用金匮肾气丸，后期维持治疗中，可以服用金匮肾气丸来降低伊马替尼生殖毒性，提高生活质量。因此本实验中选择临床日推荐服用量分别为400 mg伊马替尼与12 g金匮肾气大蜜丸，进行折算为10.00 mg：0.3 g进行研究。

为了更好的探讨金匮肾气丸可能对伊马替尼稳定性影响，设计了更高剂量组。由实验可知，当金匮肾气丸超过12倍以上会对伊马替尼在胃肠中稳定性造成影响，按照医嘱不会达到该剂量，即使考虑药物残留影响，累积浓度也达不到如此高，因此我们推测金匮肾气丸不会影响胃肠中伊马替尼消化吸收，能够保存药物活性。但伊马替尼对金匮肾气丸中苷类化合物溶出有抑制作用，尤其是马钱苷，药物之间相互作用关系复杂，有待进一步深入研究。因此，为了避免伊马替尼体内抑制金匮肾气丸中主要苷类成分溶出而降低药效，建议两者间隔2 h以上服用。

3 结论

本实验建立了一种稳定性好、精密度及准确度高的测定伊马替尼与金匮肾气丸中主要成分含量的测定方法。并用该方法分析了将伊马替尼及金匮肾气丸同时孵育于人工胃/肠液后不同时间，伊马替尼及金匮肾气丸中主要有效成分含量变化。发现伊马替尼及金匮肾气丸同时使用时，主要影响金匮肾气丸中苷类成分莫诺苷和马钱苷含量，尤其是含量较低的马钱苷。因此为了避免伊马替尼及金匮肾气丸同时服用降低金匮肾气丸疗效，我们建议金匮肾气丸谨遵说明书使用，一次一丸，每日两次服用，与伊马替尼联合使用时，间隔2 h以上服用。