酿酒酵母与球拟酵母混合发酵对白酒风味物质的影响

周钰涵，崔丹瑶，闫昕，林良才，张翠英

（省部共建食品营养与安全国家重点实验室，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

白酒是我国著名的蒸馏酒，其主要成分包括水、乙醇及微量风味物质。白酒中的风味物质占比虽然只有2%～3%，但却决定了白酒的香型与品质。白酒的风味物质包括酯类、醇类、酸类、醛类、缩醛类、酮类、酚类、吡嗪类等，其中酯类物质是占比最大的香味物质，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯[1]。乙酸乙酯能够提供果香气味，是白酒中最常见的风味物质之一，同时也是清香型白酒的主体风味物质，在清香型白酒中一般具有较高的含量[2]。

白酒中乙酸乙酯的合成途径主要分为化学合成和生物合成[3]。化学合成是指乙醇和乙酸的化学反应，生成的乙酸乙酯含量较少且生成速度较慢。生物合成是指酒曲微生物中的酶利用原料中的营养成分，通过自身的代谢途径进行产酯，是白酒乙酸乙酯的主要来源[4]。白酒中的功能性微生物主要包括酵母菌、细菌、霉菌等[5-6]。球拟酵母（Torulopsis globosa）属于非酿酒酵母（non-Saccharomyces），具有良好的产酯能力，是白酒生产应用中最广泛的生香酵母之一。包括球拟酵母在内的大部分生香酵母所产的酯类生香物质都是乙酸乙酯，也有少量酵母产己酸乙酯、丁酸乙酯[7]。邢爽等[8]证明了在自然pH值条件下，球拟酵母的产酯能力要优于卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母和汉逊酵母，酯分解能力要比其他产酯酵母低。吕磊等[9]发现在相同的培养条件下，发酵过程中的球拟酵母的总生物量要高于异汉逊酵母、酿酒酵母和意大利酵母。

如何有效提高白酒中乙酸乙酯含量，提高白酒品质一直是研究热点之一。吴轩德等[10]证明了酿酒酵母与巴氏醋杆菌混合发酵时，同步接种能够显著提高乙酸乙酯生成量。唐洁等[11]证明了酿酒酵母与异常毕赤酵母两种菌株混合发酵时，不仅能生成更多的酯类物质，还有效降低了总酸和高级醇的含量。

前期通过分子生物学方法，选育出了一株高产乙酸乙酯，同时产乙醇能力不变的酿酒酵母菌株[12-13]。张华东等[14]将醋酸菌的菌悬液添加到高产酯酿酒酵母菌悬液中，乙酸乙酯含量提高了12%。高产酯酿酒酵母与球拟酵母都具有高产乙酸乙酯的能力，但二者在白酒发酵过程中的相互作用尚不明确。本研究将工业酿酒酵母、高产酯酿酒酵母分别以不同接种体积比、不同接种顺序与球拟酵母进行混合发酵，研究球拟酵母对这两株酵母的影响，揭示球拟酵母对高产酯酿酒酵母产酯能力的强化作用，为高产酯酿酒酵母在清香型白酒发酵中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

工业酿酒酵母菌株AY15、高产酯酿酒酵母菌株MY15、球拟酵母WY2：天津市工业微生物重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂

玉米粉、高粱粉：市售；酵母膏（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津光复精细化工有限公司；乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高温淀粉酶（2.9×105U/mL）、糖化酶（1×105U/mL）：诺维信生物技术有限公司。

1.1.3 培养基

1）酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone eextrose medium,YEPD）：10 g蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酵母浸粉，定容至500 mL，自然pH值，固体培养基添加2%琼脂粉，115℃灭菌20 min。

2）酵母种子培养基：首先将500g玉米粉与1500 mL温水按料液比 1∶3（g/mL）混合，60 ℃处理 20 min。然后加入耐高温淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴处理1.5 h，降温并转移至60℃水浴锅中，加入糖化酶（200 U/g原料）处理20 h。将水解液过滤后，调整糖度至8°Bx与12°Bx，分别为一级种子培养基与二级种子培养基。最后在种子培养基中加入0.5%酵母浸粉，105℃灭菌20 min。

3）高粱半固态发酵培养基：称取80 g高粱粉放置于500 mL锥形瓶中，加入热水200 mL，加入耐高温淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴处理1 h。将培养基121℃灭菌20 min，随后迅速冷却至60℃，加入糖化酶（200 U/g原料）水浴30 min。

1.2 仪器与设备

GC 7890B气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；MS204S电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；XMTB型电热恒温水浴锅：天津市中环实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱半固态发酵接种方式

首先挑取酵母菌株一环，接种至装有5 mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24 h。将一级种子液倾倒至装有45 mL二级种子培养基的锥形瓶中，8层纱布封口后，30℃静置培养16 h，确保二级种子液中的细胞数达到5×106CFU/mL。将酿酒酵母工业菌株AY15和高产酯酿酒酵母菌株MY15以同步接种和顺序接种的方式，分别与球拟酵母进行混合发酵试验。

1）同步接种：酿酒酵母与球拟酵母分别按照1∶1、1:2、2:1的不同体积比接种，将二级种子液同时接种到高粱半固态培养基中 （A∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分别代表AY15 与 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的接种体积比进行发酵；M∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分别代表 MY15 与 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1的接种体积比进行发酵）。

2）顺序接种：先将酿酒酵母或球拟酵母中的一种接种于高粱半固态培养基中，静置培养1 d后，再接种相同数量的另一种酵母（AW和MW分别代表先接种AY15或MY15，发酵1 d后再接种WY2；WA和WM分别代表先接种WY2，发酵1 d后再接种AY15与MY15）。

接种后将锥形瓶静置于30℃培养箱中，每隔12 h检测CO2失重，失重小于0.5 g时视为发酵终止，对发酵液进行蒸馏，检测风味物质生成量。

1.3.2 风味物质生成量的检测

乙酸酯及高级醇等微量风味物质通过气相色谱进行检测。气相色谱仪的色谱柱采用AgilentHP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），载气为高纯氮气，柱流速为0.8 mL/min，进样口温度200℃，检测器温度150℃。升温程序：起始温度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150 ℃，保持 15 min；分流进样，分流比为 10∶1。

1.3.3 分析方法

酿酒酵母和球拟酵母采用血球计数板的方法进行计数；CO2释放量采用称重法；发酵液中剩余还原糖含量采用斐林试剂法[15]；酒精度的测定采用酒精计比重法。

1.4 数据处理

采用Origin 8.5软件对数据进行作图分析，数据代表3个独立重复数据的平均值和标准差，统计学分析由SPSS 19.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 单菌发酵对风味物质的影响

利用酿酒酵母菌株AY15、高产酯酵母MY15与球拟酵母WY2进行单菌发酵，发酵过程中的CO2总失重、酒精度、发酵周期和发酵液中剩余还原糖含量如表1所示。

表1 菌株单独发酵对发酵特征的影响Table 1 Effect of separate fermentation of strain on fermentation characteristics

由表1可知，3株菌株纯种发酵时，CO2总失重在26.1 g～26.2 g之间，酒精度均为9.4%vol，均无明显差异。但是AY15和MY15的发酵周期为5 d，而球拟酵母则需要7 d才能完成发酵过程。

白酒香味成分有醇类、酯类、酸类和醛类等，每种成分都对白酒的风味有不同的贡献[16-17]。本试验检测了酒样中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇的含量，结果如图1所示。

图1 菌株单独发酵对乙酸酯和高级醇生成量的影响Fig.1 The impact of single fermentation on acetate ester production

由图1可知，当3株菌株进行纯种发酵时，酿酒酵母MY15的乙酸乙酯生成量为275.19 mg/L，是野生型菌株AY15的22.3倍，证明醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的过表达使产酯能力得到了大幅度的提高。球拟酵母WY2的乙酸乙酯生成量为116.93 mg/L，同样具有较强的乙酸乙酯生成能力。酿酒酵母MY15纯种发酵时生成了35.16 mg/L的乙酸异戊酯；酿酒酵母AY15和球拟酵母WY2纯种发酵时未检测到乙酸异戊酯，这可能是由于酒样中含量过低导致气相色谱无法检测出。

球拟酵母WY2的正丙醇和异丁醇生成量分别为24.65 mg/L和124.08 mg/L，比酿酒酵母AY15的正丙醇和异丁醇生成量分别提高了1.76倍和2.48倍；异戊醇和苯乙醇的生成量为189.71 mg/L和60.96 mg/L，与菌株AY15单独发酵相比分别降低了19.07%和42.15%。由于高产酯酿酒酵母MY15中的支链氨基酸转氨酶编码基因BAT2被敲除，阻断了氨基酸生成α-酮酸的转氨过程，导致异丁醇与异戊醇低于酿酒酵母AY15。

2.2 不同接种体积比对混合发酵的影响

2.2.1 发酵性能理化指标分析

以不同接种体积比进行混合发酵，发酵性能相关指标如表2所示。

表2 不同接种体积比对发酵特征的影响Table 2 The impact of fermentation performance by different inoculation proportion

由表2可知，当酿酒酵母与球拟酵母以不同体积比接种进行发酵时，发酵周期由5 d缩短为4 d。6个试验组的CO2总失重在26.9 g～27.8 g之间，酒精度在9.5%vol～9.7%vol之间，证明了不同接种体积比对CO2总失重和酒精度没有显著影响。

酿酒酵母与非酿酒酵母以同步接种的方式进行混合发酵时，酿酒酵母能够优先利用碳源而迅速增殖，抑制非酿酒酵母的生长；非酿酒酵母可能会受到营养物质、乙醇、pH值、酵母代谢物等因素的影响，与酿酒酵母产生竞争抑制，影响发酵结果[10，18]。这种抑制效果的强弱与接种量的比例存在着密切的联系，Fan等[19]将S.cerevisiae和W.anomalus以不同接种菌数比进行混合发酵，接种菌数比6∶1时还原糖消耗速度最慢、CO2释放量最低；接种菌数比为 1∶1 和 1∶2 时，还原糖消耗量和CO2释放量是相似的，其效果优于6∶1的接种菌数比。荆雄等[20]将柠檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）与酿酒酵母分别进行了混合发酵，发酵前期非酿酒酵母和酿酒酵母会相互抑制，但并未影响最终的酒精度。在本研究中，将酿酒酵母AY15、MY15分别与球拟酵母 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的体积比接种，并进行发酵，发酵周期不仅没有延长，与酿酒酵母纯种发酵相比反而缩短至4 d。这可能是因为两种酵母接种比例相差较小，接种至发酵培养基后虽然出现了竞争抑制，但并未影响整体的发酵进程。而两种酵母的同时接种加快了混合发酵体系中还原糖被消耗的速度，这是发酵周期缩短的主要原因。

2.2.2 不同接种体积比对乙酸酯生成量的影响

发酵过程中非酿酒酵母的生长代谢可以提高原料的利用率、合成风味成分增加酒体的芳香，但酿酒酵母仍是发酵过程不可或缺的组分，将不同的非酿酒酵母与酿酒酵母进行组合，达到抑制其不良作用，发挥优良功能的目的[21]。酿酒酵母AY15和MY15分别与菌株 WY2 以不同体积比（1∶1、1∶2、2∶1）接种进行混合发酵对乙酸酯（乙酸乙酯和乙酸异戊酯）的提升效果如图2所示。

图2 不同接种体积比对乙酸酯生成量的影响Fig.2 The impact of different inoculation proportion on acetate ester production

由图2可知，接种体积比为1∶2时生成的乙酸乙酯生成量分别为 75.96 mg/L（A∶W）和 351.65 mg/L（M∶W），明显高于其他两种接种体积比。这说明了酿酒酵母的接种量会影响球拟酵母的产酯能力。接种体积比为1∶2时，球拟酵母数量占优势，减弱了酿酒酵母的抑制效果，促进了乙酸酯的生成；接种体积比为2:1时，酿酒酵母生成的乙醇与代谢物限制了球拟酵母的产酯能力，因此乙酸酯生成量较低。在Fan等[22]的研究中证明了S.cerevisiae和W.anomalus接种菌数比为1∶2时生成的乙酸乙酯是最高的，与本研究结果相似。酿酒酵母AY15与球拟酵母WY2混合发酵时同样未检测到乙酸异戊酯，这是由于酿酒酵母AY15生成乙酸异戊酯的能力较弱，球拟酵母的加入不能显著提高乙酸异戊酯的生成能力。

2.2.3 不同接种体积比对高级醇生成量的影响

酿酒酵母AY15和MY15分别与菌株WY2以不同接种体积比（1∶1、1∶2、2∶1）进行混合发酵对高级醇的影响如图3所示。

图3 不同接种体积比对高级醇生成量的影响Fig.3 The impact of different inoculation proportion on higher alcohol production

由图3可知，酿酒酵母菌株AY15与球拟酵母WY2以不同接种体积比进行混合发酵时，异丁醇和异戊醇的生成量与酿酒酵母AY15相比均被提高。但是高产酯酿酒酵母MY15与球拟酵母混合发酵时，异丁醇和异戊醇生成量没有发生变化。这可能是因为MY15菌株具有较高的酯合成酶活性，促使异丁醇和异戊醇转化为对应的乙酸酯，消耗了部分高级醇，因此混合发酵中的高级醇生成量与MY15纯种发酵时没有显著差别。有研究证明，白酒的高级醇含量过高不仅会影响白酒的风味，饮用后还会引起“上头”现象，影响人的健康。利用高产酯酿酒酵母MY15进行的混合发酵将高级醇控制在了较低的范围内，这有助于提升白酒的品质。

2.3 不同接种顺序对风味物质含量的影响

2.3.1 发酵性能理化指标分析

酿酒酵母与球拟酵母以不同接种顺序进行混菌发酵时，发酵性能如表3所示。

表3 不同接种顺序对发酵特征的影响Table 3 The impact of fermentation performance by different sequential culture

从表3中可以看出，各试验组的CO2总失重在25.5 g～26.2 g之间，酒精度均为9.5%vol，发酵周期均为5 d，与AY15和MY15纯种发酵相比均没有显著差异。这说明以1 d的时间间隔进行顺序接种时，酿酒酵母和球拟酵母的产酒精能力未受到明显的影响，这有利于白酒的酿造。杨婕等[23]发现，将L.thermotolerans菌株与S.cerevisiae以顺序接种进行发酵时，混合体系中的酒精度会低于S.cerevisiae纯种发酵。在吴轩德等[10]的研究中，先接种 S.cerevisiae，发酵 24 h 后再接种A.pasteurianus时，酒精度也出现了明显降低。这些结果与本研究结果有所不同，这可能是由于球拟酵母菌种的发酵性能不同于L.thermotolerans和A.pasteurianus，在混合发酵体系中虽然存在竞争关系，但依旧能保持较好的产酒精能力。

2.3.2 不同接种顺序对乙酸酯生成量的影响

不同的接种顺序对混合发酵体系中乙酸酯生成量的影响如图4所示。

图4 不同接种顺序对乙酸酯生成量的影响Fig.4 Effect of different inoculation sequence on the production of acetate ester

由图4可知，以“酿酒酵母—球拟酵母”的顺序接种时，试验组AW和MW的乙酸乙酯生成量分别为15.37 mg/L和310.36 mg/L，与AY15和MY15纯种发酵相比分别提高了24.55%和12.78%。这说明先接种酿酒酵母再接种球拟酵母有利于乙酸乙酯的生成。以“球拟酵母—酿酒酵母”的顺序接种时，试验组WA的乙酸乙酯生成量明显提高，是AY15单独发酵的2.05倍，但试验组WM的乙酸乙酯生成量（189.91 mg/L）却低于MY15纯种发酵。这意味着球拟酵母的优先接种使菌体数量快速增长，增强了与酿酒酵母的竞争关系，影响乙酸乙酯的生成。由于酿酒酵母菌株AY15的产酯能力远低于球拟酵母，在顺序接种发酵时，球拟酵母能够发挥产酯能力，小幅度地提升发酵体系整体的乙酸乙酯生成量；但高产酯酿酒酵母菌株MY15的产酯能力强于球拟酵母，因此球拟酵母的先接种虽然影响了MY15菌株的生长，但MY15菌株依然保持了其高产酯的发酵特性。顺序接种发酵结束后，试验组WM的乙酸乙酯生成量较球拟酵母单独发酵相比，提升1.62倍。

2.3.3 不同接种顺序对高级醇生成量的影响

不同的接种顺序对混合发酵体系中高级醇生成量的影响如图5所示。

图5 不同接种顺序对高级醇生成量的影响Fig.5 Effect of different inoculation sequence on higher alcohol production

由图5可知，各试验组的正丙醇生成量和苯乙醇生成量与AY15、MY15和WY2纯种发酵的生成量相似，正丙醇生成量在17.84 mg/L～25.06 mg/L之间，苯乙醇生成量在64.26 mg/L～79.44 mg/L之间，而异丁醇生成量在先接种球拟酵母的试验中提升了一倍。试验组AW和WA异戊醇生成量比酿酒酵母AY15纯种发酵生成量低，高于球拟酵母WY2纯种发酵，而试验组MW和WM异戊醇生成量低于AY15和WAY2纯种发酵。因此，混合发酵体系中的高级醇终生成量决定于先接种菌株的高级醇生成量，后接种球拟酵母的方法，对高级醇生成量没有太大的影响，甚至可以少量降低高级醇生成量。

3 结论

以工业酿酒酵母菌株AY15、高产酯酿酒酵母菌株MY15、球拟酵母WY2为出发菌株，分别通过单菌发酵、不同接种体积比的混菌发酵和不同接种顺序的混菌发酵，检测其发酵过程中发酵性能、乙酸酯及高级醇生成量的变化。结果表明，不同接种体积比以及不同接种顺序对酵母发酵性能和高级醇生成量没有显著影响。当高产酯酿酒酵母MY15和球拟酵母WY2接种体积比为1∶2时生成的乙酸乙酯含量最高，为351.65mg/L。近几年，非酿酒酵母的研究成为酿酒领域的热点，但是对球拟酵母研究比较少。因此，将高产酯酿酒酵母与球拟酵母进行单独和混菌发酵,发现混菌发酵优于单独接种酿酒酵母或球拟酵母，在保证酵母发酵性能不变的前提下,能有效地利用发酵液中的酸类物质和高级醇,合成更多的酯类化合物，明显提高了发酵产品的风味特征，揭示了球拟酵母对高产酯酿酒酵母产酯能力的强化作用，为高产酯酿酒酵母在清香型白酒发酵中的应用提供理论依据。