UPLC法同时测定白虎汤中4种成分

景梦晓， 吕邵娃， 付婷婷， 刘紫衡， 李永吉

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

白虎汤出自《伤寒论》，由石膏、知母、甘草、粳米4味药材组成，功效清热泻火、除烦生津，是治疗阳明热证的经典方剂，在解热、抑菌、抗炎、镇痛、增强免疫、抗痛风、降血糖、降脂、减轻肿瘤治疗不良反应、抑制皮脂腺增生等方面均有作用[1-3]。目前，对白虎汤含量测定的研究主要集中在不同配伍条件对某些成分的影响[4-9]，但只测定某一成分的含量；另外有采用HPLC法测定方中4种成分的含量[10]，但该方法检测时间较长，分离度低。因此，本实验建立UPLC法同时测定白虎汤中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵的含量，而且该方法取样量少，简单快速，灵敏度和分离度高，可为有效控制该方质量提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 炙甘草(批号170201)、石膏(批号SAO251)(安徽广印堂中药股份有限公司)；知母(批号20160512，北京本草方源药业有限公司)；粳米为市售。芒果苷(DST180513-010)、新芒果苷(DST180630-017)、甘草酸铵(DST180422-012)、甘草苷(DST180321-014)对照品均购自成都德思特生物技术有限公司，纯度均>98%。乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯；水为屈臣氏饮用水。

1.2 仪器 ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；ATGL-16C-高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；煎煮锅(潮州市顺创陶瓷有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得(质量浓度分别为0.32、0.32、0.1、0.4 mg/mL)。

2.2 供试品溶液制备 取知母6两(93.75 g)、甘草2两(31.25 g)、粳米6合(120 mL)，置于1斗(1 981 mL)水中浸泡30 min，加入生石膏(碎)1斤(250 g)后一起转入砂锅中，武火煮沸后转至文火煎煮40 min，4层纱布趁热过滤得到汤液约850 mL。取1 mL，50%甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，超声处理30 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液约2 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

2.3 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～1 min，5%～10%B；1～3 min，10%～14%B；3～5 min，14%～18%B；5～6 min，18%B；6～9 min，18%～19%B；9～12 min，19%～55%B；12～15 min，55%～62%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长256 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 精密移取对照品、供试品溶液各1 μL，在“2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分峰形完整，分离度高，表明该方法专属性良好。

1.新芒果苷 2.芒果苷 3.甘草苷 4.甘草酸铵1.mangiferin 2.neomangiferin 3.liquiritin 4.ammoniumglycyrrhizinate图1 各成分UPLC色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 取芒果苷对照品溶液，甲醇稀释至40、60、80、160、320、640 μg/mL；取新芒果苷对照品溶液，甲醇稀释至60、80、160、320、640、1 280 μg/mL；取甘草苷对照品溶液，甲醇稀释至10、25、50、100、150、200 μg/mL；取甘草酸铵对照品溶液，甲醇稀释至40、65、80、100、200、400 μg/mL。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.4.3 精密度试验 取上述4种供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.91%、2.42%、3.00%、1.37%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于配制后0、2、4、6、8、10 h在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为1.82%、1.32%、1.16%、1.19%，表明溶液在10 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批饮片，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.89%、1.89%、2.72%、1.74%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取汤剂6份，每份0.5 mL，加入0.5 mL对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.5 样品含量测定 取饮片6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长筛选 本实验采用紫外分光光度计，在200～400 nm波长范围内进行扫描，发现对照品、供试品溶液均在256 nm处有最大吸收峰，故选择其作为检测波长。

3.2 检测指标筛选 白虎汤中粳米含有大分子多糖类物质，在PDA检测器无法被检出[11]；石膏作为矿物药，其主要成分为含水硫酸钙，在该检测器也无法被检出[12]。因此，本实验选择知母、甘草所含主要成分作为检测指标。

3.3 色谱条件筛选 本实验考察了HPLC、UPLC法，并通过查阅相关文献对出峰时间、分离度、检测灵敏度进行分析，最终选择UPLC法，相比于HPLC法可大大缩短分析时间，提高效率，减少溶剂消耗[13-15]。

此外，前期已有报道采用UPLC法测定白虎汤中指标成分含量，但采用等度洗脱，而且仅限于1种成分，无法全面反映该方质量，故本实验采用梯度洗脱，不仅缩短了分析时间，还使得4种成分色谱峰均达到了较好的分离度。此外，在分离色谱峰时为了得到分离度好、峰形完整的色谱峰，本实验在流动相中加入了适量甲酸，既抑制了白虎汤中水溶性酸性成分的分解，又得到了理想的色谱峰峰形。

4 结论

本实验建立了UPLC法同时测定白虎汤中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、草酸铵的含量，发现该方法较HPLC法更简便、快速、准确，重复性更好，可为该方后期进一步研发奠定基础。