不同品种绿豆对硒胁迫的响应特性分析

崔长珍，王 鹏，屈香香，刘 畅，相微微，王建武

（榆林学院生命科学学院，陕西榆林 719000）

我国72%的县市属于低硒或缺硒区，生活在缺硒地区的人口有7 亿之多，缺硒地区的人们每天从食物中摄入硒的量远远低于硒需要量的上限，而通过硒营养强化的方式来补硒是一种方便有效的途径。绿豆（Vigna radiata）属豆科草本植物，是人类重要的杂粮作物之一[1]，其适应性强，耐贫瘠，固氮养地，营养价值丰富，而且还具有很多种药理作用[2]。绿豆不仅具有高蛋白、低脂肪的特性，而且具有较高的维生素和矿物质含量[3]，虽说不是主食，却是人们经常食用的食品，开发富硒绿豆对于满足人体的合理补硒具有更高的可行性。目前，市场上开发的绿豆富硒产品，一部分是利用亚硒酸钠或氨基酸硒水溶制剂对绿豆进行浸泡或者喷淋处理后，使之萌发成芽苗菜，然后食用[4-7]；还有部分是利用叶面喷施法对绿豆进行补硒，通过一系列的生理生化反应，将无机硒吸入绿豆植株体内，转化为有机硒富集在绿豆籽粒中，然后食用[8]。但针对不同品种绿豆对硒的吸收、转运和富集方面差异研究尚未见报道。

本研究以12 种绿豆为研究对象，探究了不同品种绿豆对硒胁迫响应的生理差异，旨在为选育富硒绿豆品种提供一定理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试绿豆种子分别为维绿9 号、榆绿2 号、苏拉2 号、中绿8 号、冀绿10 号、冀绿7 号、绿联I17白绿-11 号、白绿6 号、保942-34、中绿3 号、横山绿豆、天山大明绿豆2 号，共12 个，均由榆林市农业科学研究院小杂粮研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 亚硒酸钠营养液的配置 用1/10 的营养液和固体亚硒酸钠，参考MEHDAWI 等[9]的试验方法，配制20、30 mg/L共2 种不同浓度的亚硒酸钠营养液。

1.2.2 绿豆幼苗培养及处理 挑选籽粒饱满、形态一致、完好无损的绿豆种子，经清洗消毒后，自然风干；采用榆林当地的黄土与蛭石1∶1 的比例配制培养土，然后每个品种选取18 粒种子，一盆种6 粒种子，3 个重复，置于光照培养间培养（温度为24 ℃，光照强度为8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）。随后每天观察长势，适时浇水；待长到三叶一心时开始用20 mg/L 的亚硒酸钠溶液进行浇灌[10]。处理28 d 后记录形态变化，并将地上部分和地下部分洗净烘干，送到北京莱析检测技术有限公司，利用ICP-MS（ThermoFisher ICAP Q）测定硒含量。

挑选籽粒饱满、形态一致、完好无损的绿豆种子，经清洗消毒后，自然风干；然后将种子置于铺有滤纸的培养皿中培养，待长出约1 cm 的根时，将其移栽进行水培，置于光照培养间培养（温度为24 ℃，光照强度为8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）；待长到三叶一心时，将营养液换为亚硒酸钠营养液，用20、30 mg/L 的亚硒酸钠营养液处理[4]，对照组为不加硒的营养液。处理5 d 后，测定其叶片的氧化应激生理指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 形态指标测定 在同一时间、同一浓度的亚硒酸钠营养液处理下，土培28 d 后观察并记录不同品种绿豆叶片颜色、茎的颜色、叶片干枯程度变化。

1.3.2 硒的富集转运能力测定 其参考乔斌[11]的方法进行。

1.3.3 氧化应激生理指标测定 超氧化物歧化酶活性（SOD）的测定参考王学奎[12]的方法进行；过氧化物酶（POD）的测定参考裴帅帅[13]的方法进行；过氧化氢酶（CAT）的测定参考李柏林等[14]的方法进行；丙二醛（MDA）含量测定参考王晓栋[15]的方法进行。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0 及WPS 2016 软件进行方差分析与作图；采用单因素方差分析进行差异显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 亚硒酸钠对绿豆形态指标的影响

表1 不同绿豆品种处理前后形态指标的变化

由表1 可知，不同品种绿豆对硒的耐受性不同，因而在形态变化上有明显差异，相同处理条件下，榆绿2 号、保942-34 和横山绿豆的叶片颜色仍为深绿色，与处理前相比基本不变，而其他品种的叶片颜色明显变黄；绿豆茎的颜色前后并无明显变化，只有品种间本来的茎色差异；冀绿7 号和绿联I17 白绿-11 号干枯较为明显，而维绿9 号、苏拉2 号、中绿8 号、冀绿10 号、白绿6 号、保942-34和中绿3 号表现正常，没有干枯，其他的则是整盆干枯，不同品种的干枯程度有所差异。

2.2 不同品种绿豆的富集转运能力变化

硒含量测定结果表明（表2），不同品种绿豆叶和根中硒含量差异明显，叶含硒量最低的品种为天山大明绿豆2 号（84.46 mg/kg），最高的品种为保942-34（317.02 mg/kg）；根含硒量最低的品种为横山绿豆（1 107.97 mg/kg），最高的品种为冀绿7 号（2 855.92 mg/kg）。

表2 不同品种绿豆叶和根中硒含量及转运系数

不同品种绿豆对硒的转运系数由大到小排列为保942-34＞横山绿豆＞维绿9 号＞榆绿2 号＞冀绿7 号＞中绿3 号＞白绿6 号＞苏拉2 号＞绿联I17 白绿-11 号＞冀绿10 号＞中绿8 号＞天山大明绿豆2 号（表2）。根据不同品种绿豆对硒的转运系数大小不同，结合硒胁迫下形态指标变化，初步判断富集硒能力最强的品种是保942-34，富集硒能力最弱的品种是天山大明绿豆2 号。筛选出这2 个品种后，进一步比较硒胁迫下，2 个品种绿豆在氧化应激生理方面的差异。

2.3 硒胁迫对2 个品种绿豆氧化应激生理指标的影响

在水培条件下，用20 和30 mg/L 的亚硒酸钠营养液处理保942-34 和天山大明绿豆2 号2 个品种绿豆，对照组为不加硒的营养液，处理5 d 后，测定氧化应激生理指标。

2.3.1 硒胁迫对绿豆叶中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 超氧化物歧化酶（SOD）是一种清除含氧自由基的酶。从图1 可以看出，在质量浓度为20 mg/L 的亚硒酸钠处理下，保942-34 的SOD 活性显著高于天山大明绿豆2 号（P＜0.05）；而在质量浓度为30 mg/L 的亚硒酸钠处理下，天山大明绿豆2 号SOD 活性显著高于保942-34（P＜0.05）。但总体而言，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，保942-34的SOD 活性先上升后下降，而天山大明绿豆2 号SOD 活性逐渐上升，保942-34 的SOD 活性在质量浓度为20 mg/L 的亚硒酸钠处理下最大，达到75.693 U/g。

2.3.2 硒胁迫对绿豆叶中过氧化物酶（POD）活性的影响 过氧化物酶（POD）可以催化H2O2氧化分解为H2O、O2，减少H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。由图2 可知，在质量浓度为20 mg/L 的亚硒酸钠处理下，天山大明绿豆2 号POD 活性显著高于保942-34（P＜0.05）；而在质量浓度为30 mg/L的亚硒酸钠处理下，保942-34 的POD 活性显著高于天山大明绿豆2 号（P＜0.05）。但总体而言，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，保942-34 的POD 活性逐渐上升，而天山大明绿豆2 号POD 活性先上升后下降，天山大明绿豆2 号POD 活性在质量浓度为20 mg/L 的亚硒酸钠处理下最大，达到3.24 U/g。

2.3.3 硒胁迫对绿豆叶中过氧化氢酶（CAT）活性的影响 过氧化氢酶（CAT）属于活性氧清除剂，可以分解机体代谢过程中产生的活性氧如过氧化氢、超氧阴离子等。从图3 可以看出，在质量浓度为20、30 mg/L 的亚硒酸钠处理下，保942-34 的CAT活性均显著高于天山大明绿豆2 号（P＜0.05）。但总体而言，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，保942-34 和天山大明绿豆2 号的CAT 活性均先下降后上升，保942-34 的CAT 活性在未加亚硒酸钠处理下最大，达到348 U/g。

2.3.4 硒胁迫对绿豆叶中丙二醛（MDA）含量的影响 丙二醛（MDA）是植物组织在衰老或逆境条件下，发生脂质过氧化作用的终产物之一，其含量大小可以反映植物遭受逆境伤害的程度。从图4 可以看出，在20 mg/L 的亚硒酸钠处理下，天山大明绿豆2 号的MDA 含量显著高于保942-34（P＜0.05）；而在30 mg/L 的亚硒酸钠处理下，保942-34 的MDA含量略高于天山大明绿豆2 号，但差异不显著（P＞0.05）。总体而言，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，天山大明绿豆2 号的MDA 含量逐渐下降，而保942-34 含量逐渐上升，天山大明绿豆2 号的MDA含量在未处理时含量最高，达1.32 μmol/g。

3 结论与讨论

叶片膜保护酶系统主要包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶，这3 种酶的活性大小是衡量植物对逆境抗性强弱的重要指标之一[16]。CAT可以消除H2O2，从而减少H2O2的积聚，降低其对细胞的损坏作用。POD 与光合作用等有关，可以在一定情况下使H2O2还原成水，其活性会随其他因素而产生相应的变化。SOD 是一种金属酶，有3 种类型[17]，其会影响植物的抗逆性和衰老，也可以消除有害的自由基，并且在氧化和抗氧化反应中有着极为重要的功能[18]。本研究中，这3 种酶的活性在高质量浓度亚硒酸钠处理时变化趋势不同，保942-34叶中SOD 的活性随亚硒酸钠质量浓度的升高先上升而后降低，而POD 活性随亚硒酸钠质量浓度的升高而升高，CAT 活性随亚硒酸钠质量浓度的升高而先下降后上升；天山大明绿豆2 号叶片中SOD的活性随亚硒酸钠质量浓度的升高而升高，而POD的活性随亚硒酸钠质量浓度的升高而先上升后降低，CAT 活性随亚硒酸钠质量浓度的升高而先下降后上升，CAT 活性二者表现一致。说明随着硒胁迫的加剧，绿豆体内的H2O2含量持续升高，进而诱导CAT 活性持续升高，POD 和SOD 在植物体内参与的生理过程更多样，不同绿豆品种POD 和SOD 对硒胁迫的响应可能存在差异；此外，保942-34 转运系数最高，转运系数高会造成绿豆地上部分硒积累量升高，天山大明绿豆2 号转运系数最低，地上部分硒积累量只有保942-34 的26.66%，这2 个品种绿豆地上部分硒含量差异可能也会造成POD 和SOD 活性变化不一致。在30 mg/L 亚硒酸钠时，保942-34 的POD 和CAT 的活性均高于天山大明绿豆2 号，清除超氧阴离子自由基的能力也最强，对硒的耐受性较好。

丙二醛的含量是衡量植物对逆境抗性的一项重要生理指标，在逆境环境中植物器官会发生膜质过氧化作用，丙二醛便是其终产物之一[19]。保942-34 叶中MDA 的含量随亚硒酸钠质量浓度的升高而升高，天山大明绿豆2 号MDA 含量随亚硒酸钠质量浓度的升高而下降。保942-34 的丙二醛在亚硒酸钠质量浓度为30 mg/L 时达到最大值，而天山大明绿豆2 号的丙二醛在亚硒酸钠质量浓度为20 mg/L 时达到最大值，2 种绿豆相比，天山大明绿豆2 号在20 mg/L 亚硒酸钠质量浓度时的丙二醛含量最高，说明此时膜脂过氧化作用最为严重，对硒的耐受性也就较差。虽然没有证据表明Se 是植物必需的微量元素，但低剂量的Se 能促进植物的生长，显著增强酶促和非酶促抗氧化系统的活性，并提高植物对非生物胁迫的抗性。早在1930 年，人们就发现了Se 超富集植物，主要是豆科的黄芪属植物以及假含羞草属植物、十字花科的鸡冠花属植物，但由于这些植物跟模式植物的亲缘关系较远，对其富硒的遗传和分子机制研究一直没有深入进行[20]。

本研究通过对12 个绿豆品种对硒的富集转运能力的测定以及无机硒对其中2 种绿豆品种生理指标的测定，结果表明，不同绿豆品种对硒的吸收和转运存在明显差异，供试绿豆品种中保942-34硒的转运系数最高，且对硒耐受性最好，本研究可为进一步深入研究绿豆对硒的吸收和转运机制提供参考。已有研究证实，环境低硒是引起多种流行病的重要因素[21]，很多作物在硒生态链中可以将无机硒转化为有机硒，而人和动物对有机硒的吸收和利用远大于无机硒。本研究证实，不同品种绿豆对硒的吸收和转运能力存在明显差异，研究结果可为筛选富集硒能力强的绿豆品种提供参考，对缺硒地区有效防止硒缺乏症[22]和富硒作物的推广和利用具有重要意义，也可为通过施硒肥种植富硒绿豆提供参考[23]。