不同生境下长梗韭生物学特性及遗传差异研究

赵 露，董恬雅，张社欢，刘桂霞

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

长梗韭[Allium neriniflorum（Herb.）G.Don]，葱属多年生草本植物，生长于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、山东、内蒙古、北京等地的山坡、湿地、草地或海边沙地[1]；长梗韭不具葱蒜味，胚珠数多，花被片下部靠合，鳞茎球状或近球状，单生，开紫花，花色艳丽，是园林造景中花境的好材料，植于石旁更具情趣。它是一类集菜用、调味、药用、保健、饲用和防风固沙为一体的多功能野菜植物[2]。野生葱属植物是重要的蔬菜植物，在民间，人们将嫩叶和鳞茎作凉拌菜、馅或汤食用，甚至花序也用作调制食物[3]。长梗韭含抗坏血酸（ascorbic acid），《蒙植药志》记载，其鳞茎味辛、苦，性温，有通阳散结、下气之效，可用于胸闷刺痛、心绞痛、泻痢后重、慢性气管炎、咳嗽痰多等病症的治疗，鲜品可解河豚中毒。长梗韭又有消肿散瘀之功效，可用于治疗跌打损伤、瘀血疼痛、肿胀、闪伤、扭伤[4]。

长梗韭富含多种营养元素，同时富含粗纤维。此外，长梗韭还有温中行气、散血解毒、保暖、健胃整肠等功效。长梗韭的观赏、食用及药用价值较高，但野生资源量在下降。目前，对长梗韭保护和开发利用的力度不够，与其相关的研究十分缺乏且大多集中于染色体方面[5]。从野生长梗韭染色体数目和形态方面研究其分类学意义，认为将长梗韭放在葱属合被组中更为合理[6]；通过引种栽培发现，长梗韭为二倍体2n-x2-16，其染色体带有1 对中间随体[7]；也有研究讨论了随体染色体的数目、形态变异及杂合现象在葱属进化中的作用，认为随体染色体形态变异及杂合现象的出现是葱属中遗传变异的重要源泉之一[8]。当前对有关野生长梗韭种质资源和遗传多样性的研究还非常欠缺。

ISSR 是一种双亲遗传的核基因组分子标记技术，操作简单快速，扩增特异性强，重复性好，能够检测到更多的变异位点等，且无需预知基因组序列信息，减少了多态性分析的预备工作。因此，这一分子标记被越来越广泛地应用在研究濒危珍稀物种的遗传多样性中[9-12]，真实地反映不同地理种群的遗传多样性、遗传结构及种群之间的基因交流情况[12]。

为了合理地评估野生长梗韭的遗传多样性及其遗传结构状况，并为该物种的保护提供参考依据，本研究采用ISSR 分子标记技术对来自不同生境，分别是易县林下耐阴环境和张家口草原干旱环境生长的长梗韭，进行了生物学特性和遗传多样性方面的研究，分析长梗韭对不同环境的适应性，以期为长梗韭资源的保护和开发利用提供理论依据。

1 材料

本研究所用材料取自野生的长梗韭，共用27 个样品，其中：易县样本16 个，取自河北省保定市易县千佛山林下，均为新长出的嫩叶；张家口样本11 个，取自河北省张家口市塞北管理区干旱草地，也均是新长出的嫩叶。

图1 河北坝上典型草原长梗韭（花期）

图2 张家口坝上长梗韭（花期）

2 方法

2.1 野外考察

2014 年7－10 月底到河北省张家口和易县进行野外考察，观察野生长梗韭的野外生长情况，记录整理长梗韭的生物学特性值，并采集不同生境的材料用于遗传差异分析。

2.2 ISSR 遗传多样性分析

2.2.1 基因组DNA 的提取。用试剂盒提取基因组DNA，将得到的样品于冰箱-20℃的环境下保存备用。同时，为了得到非常直观的效果，用1%的琼脂糖电泳检测DNA 的质量；为了得到十分确切的DNA 浓度，用紫外分光光度计测量DNA 的OD 值。

2.2.2 ISSR 引物的选取。为了保证试验进行的完整性，引物应不止1 种，选取所需ISSR 引物，并请生物公司合成，表1 为所合成的引物。

表1 ISSR 引物

2.2.3 PCR 扩增。按试验的退火温度确定合适的PCR扩增程序。按10mL 反应体积，对模板DNA、Taq 酶、dNTP 和引物剂量分别进行优化筛选。经多次试验比较，PCR 反应最优体系见表2（加超纯水至10μL）。

表2 PCR 反应最优体系（10μL）

为了获得最佳反应体系，在PCR 仪上对Mg2+浓度、dNTPs 浓度、引物浓度、TaqDNA 聚合酶单位数进行试验筛选。体系优化选用引物为ISSR-3（CCAGTGGTGGTGGTG），依照扩增条带强弱、主带是否清晰与杂带多少判断体系的优劣。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min；45℃复性1min；72℃延伸1.5min，35 个循环；72℃延伸15min。扩增反应结束后，将扩增产物在含有溴化乙锭（EB）的3%琼脂糖凝胶中电泳分离，DNA 分子量标记为DL 2000，以5V/cm 的电压电泳1.5h。电泳结束后，在紫外分析仪上观察扩增条带。

2.2.4 ISSR-PCR 产物的检测。ISSR-PCR 产物在3%琼脂糖凝胶上电泳80min，电压设定为100V，用EB 显色，凝胶成像仪拍照记录。

3 结果与分析

3.1 野外考察结果与分析

野外观察测量2 种生境长梗韭的一些生物学特性值。由表3 分析可知，2 种长梗韭的生物学特性差异较大，尤其是花期、花色、花葶高度和叶片长度，都发生了显著变化。因此，初步确定同一物种在不同的生境下发生了形态上的变化。有研究者对长梗韭进行引种栽培，第1 年取原产地生长的鳞茎所发的根尖观察，发现随体染色体无任何杂合现象；第2 年取在新环境下生长的鳞茎所发的根尖观察，发现随体染色体首先作出反应，发生变异产生了杂合，这是由自然条件发生了较大的变化而造成的[9]。事实上，植物种内不同种群的差异大多由基因控制，基因对性状的控制起着决定性的作用，因此从分子水平研究遗传多态性是否发生了变化更为可靠[13]。

表3 长梗韭各项生物学特性数值

3.2 ISSR 遗传多样性分析

3.2.1 试剂盒提取的基因组DNA 的电泳结果与分析。①经DNA 的凝胶电泳检测显示，点样孔不发亮，DNA主带清晰，无弥散带，无明显的RNA 带，说明质量较高。②通过紫外分光光度计测量OD 值来测量提取的DNA 样品浓度，26 个样品中，DNA 浓度较为均一，在3～5mg/uL 之间。因为浓度较高，所以需要稀释100 倍左右作为模板进行PCR。

3.2.2 PCR 扩增产物的电泳结果与分析。通过引物优化，从50 个引物中筛选出12 条扩增条带较多、信号较强、背景清晰的引物用于2 个长梗韭群体DNA 样品的扩增。通过PCR 扩增，获得了70 条强度和清晰度均较好的条带，每条单引物平均扩增条带数达6 条。扩增条带数和多态位点百分率在12 个引物中存在显著差异。这些引物的扩增片断大小范围在250～2000bp 之间。引物ISSR-3 在2 个长梗韭群体部分样品中的扩增电泳图谱见图3。如图3 中箭头所示，引物ISSR-3 共扩增到9 条主带，其中4 个条带表现为多态性。

图3 ISSR-3 引物对部分长梗韭样品的扩增结果

3.2.3 长梗韭遗传差异分析。供试材料遗传差异性分析结果如图3 所示，根据条带特异性不同，可知因为生存环境的不同，生活在坝上干旱草地的和生活在易县林下的长梗韭遗传基因已经发生了变化，这种基因改变是否有利于其更好地适应环境有待进一步探究。因此，可通过POPGENE 软件对2 种生境长梗韭遗传变异进行分析。

经POPGENE 软件分析，易县长梗韭和张家口长梗韭2 个群体及其两群体整体水平的遗传多样性指数见表4。分析可知，易县长梗韭的遗传多样性水平与张家口长梗韭的遗传多样性水平不一样，生境不同群落的遗传多样性发生了改变。

表4 2 个长梗韭群体的遗传多样性分析

如表5 所示，通过总基因多样性（Ht）和群体内基因多样性（Hs）计算得到两群体之间的基因分化系数Gst 为0.517，表明遗传变异存在于种群内，群体间的遗传变异较大。经群体遗传分化分析，群体之间的Nm=0.4791＜1，说明易县长梗韭和张家口长梗韭之间由于遗传漂变而发生了分化。因此，可以断定2 个种群间遗传多样性与环境有关，2 个生境的长梗韭基因发生了变化，同时在基因的表达过程中也发生了改变。

表5 2 个长梗韭群体基因多样性Nei’s 分析

4 讨论

4.1 长梗韭ISSR 反应体系的优化

有研究认为，为了获得重复性和可靠性较高的ISSR 谱带，并提高分析的准确性，对不同试验条件下的ISSR-PCR 反应体系进行优化是必要的[14]。应用ISSR 技术研究植物遗传差异需要进行预试验，筛选出较稳定的ISSR-PCR 的反应体系。在优化体系初始过程中，我们采用多次单因素设计的方法，因多种因素影响，试验周期较长，做了大量的PCR 扩增，工作效率较低。另一种方法可采用数学分析，因为计算较为复杂并且影响因素较多，难以较快实施，2 种方法都需要进一步优化。

4.2 遗传差异性分析意义

遗传差异性对一个物种适应环境变化长期生存繁衍至关重要。为了合理制定濒危物种的保护管理策略，应对种群内和种群间遗传差异有较清晰的认识[15]。本试验中的基因分化系数Gst 为0.5107，表明2 种生境长梗韭种群的遗传结构水平较低，这也表明群体间的遗传变异占总体遗传变异的相当比例。因而，可以推测认为，为了适应环境的需求，不同群体的长梗韭的基因发生了改变。通过基因分化系数（Gst）推导出长梗韭群体之间每代迁移个体数（Nm）仅有0.4791，较低的Nm可能反映了这2 个长梗韭种群在历史上没发生过基因交流。因此，保护长梗韭需要尽可能地保护不同生境下的有效种群，这样才能保护这个物种的遗传多样性。

本研究进行的ISSR 遗传变异分析表明两群体的种群分化水平较高而基因流水平较低，两地长梗韭在遗传上差异较大。试验结果与杭焱等[10]的研究结论一致，表明ISSR 技术能应用于不同地理种群的遗传多样性、遗传结构及种群之间的基因交流情况方面的研究。长梗韭为研究较少的野生种，在2 种完全不同的生境中仍然能很好地生存，可以对此2 种生境的个体进行基因测序，从基因的水平更好地研究植物抗旱耐湿的机制，这对我们将野生种的优势利用转基因技术转到传统种植作物上有很大的帮助。同时，长梗韭作为野菜和药用资源，研究其遗传差异性，可为长梗韭保护方案提出合理性建议，为长梗韭品种改良与种质资源创新提供依据，有助于了解物种的遗传分化机制，对保护并进一步合理利用长梗韭资源具有重要理论意义与实践价值。