植物组培室污染菌的调查及预防措施

●张红利 （天水市果树研究所 甘肃 天水 741000）

植物组织脱毒快繁技术已广泛应用于科研和生产，在果树花卉苗木快繁、无病毒苗木培育、代谢物质生产以及植物新品种培育和改良上发挥着重要作用。植物组培发展至今，已经奠定了深厚的理论和实践基础，但仍存在一些技术问题，如组培瓶苗生产过程中的污染，在试管苗工厂化简化生产中对组培成本有着较大的影响。在植物组培实验室培养条件下，对污染菌的发生种类及生长速度进行了调查，并分析产生的原因，为植物组织培养污染防控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查地点及条件

调查于2019年在天水市果树研究所植物组培实验室进行。实验室内冬季有暖气，其余季节为自然室温，室内周年温度在18～32 ℃，最高温度在5～7月。实验室严格按照组培操作管理制度，进行培养基灭菌、组培材料超净工作台无菌转接，接种室、培养室用75%酒精喷洒1次/d，每周用必洁士（二氧化氯）熏蒸1次。

1.2 调查材料

调查材料选择实验室大量生产的苹果砧木珠美海棠试管苗。每月取100瓶扩繁试管苗，调查污染菌种类和各污染菌的发生数量，计算各污染菌的发生率和整体污染率。

1.3 污染菌的生长测定

使用珠美海棠扩繁培养基，对产生的污染菌进行分离纯化，测定各污染菌的生长速度。将培养基表面出现黏液状菌斑的污染菌认定为细菌；在培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色孢子层症状的认定为真菌。

1.3.1 细菌生长曲线测定用无菌移液器吸取测菌液0.2 mL，接种到9支空白液体培养基中。将接种后的液体培养基置于振荡器上，在22 ℃条件下振荡培养，分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h后取出，较早取出的可放在2 ℃低温冰箱中冷藏。以未接种的空白液体培养基作为空白对照，选用350～400 nm波长的滤光片进行比对。以光密度为纵坐标，时间为横坐标，绘出生长曲线图。

1.3.2 真菌生长曲线测定用打孔器取大小一致的菌块，每个菌种接种3个培养瓶。将接种培养瓶放置在16 h光照、24 ℃人工气候箱内培养，记录开始培养时间。分别测量培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的菌落直径。取3个重复平均值，绘制菌种在培养条件下的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 培养室主要污染菌的发生调查

通过对珠美海棠试管苗污染菌发生情况进行调查，发现污染菌主要有4种（表1）。其中2种为细菌性污染菌，年平均污染率分别为0.83%和1.83%；2种为真菌性污染菌，年平均污染率分别为5%和4.5%；全年培养室污染率达到11.25%。月污染率最高期发生在4～7月，6月最高，达到26%。4～8月培养室温度较高、湿度较大，最高温度为32 ℃，实验室周边因大树遮阴，加上雨 季在6～8月，室内湿度在80%以上。

表1 组培室周年试管苗污染统计情况

2.2 组培室发生菌的分离纯化

对培养室出现的4种污染菌进行分离纯化培养（图1），并分别测定生长速率，绘制出生长曲线（图2和图3）。

从图2可以看出，2种细菌污染菌在液体培养基中，基本处于平直缓慢生长状态，扩散速度较小，红色细菌在4 h时有一个较快的生长高峰，之后又趋于同步。

从图3可以看出，2种真菌污染菌在第2～3天时达到快速生长阶段，第4天以后进入缓慢扩散生长阶段，2种真菌生长速度基本同步，灰色真菌直径略大于白色真菌。

3 污染菌的发生时间

由表1可知，该培养室污染主要发生在4～8月，此外，11月和12月也是污染高峰月。从结果来看，4～8月污染率分别为14%、20%、26%、14%、9%，11月和12月污染率分别为11%、9%。天水4～7月气温持续升高，6～8月为雨季，而11～12月因室内有供暖，温度维持在较高水平。说明相同管理条件下，植物组培室污染菌的发生与培养温度、湿度有较大的相关性。

4 污染防治

植物组培室污染防治：做好外植体灭菌、接种器械灭菌、培养环境消毒，严格按无菌操作规程操作。

4.1 保持培养室温度的恒定

培养室温度保持在（25±2）℃，在普通无恒温条件的培养室，高温季节在控制好培养室周边环境卫生的情况下，在无风的清晨或傍晚，开窗通风降温，促进室内空气的流通。培养室湿度高于60%时，可通过除湿机除湿，减少因高温、高湿引起的试管苗污染。温湿度不好控制的培养室，可调整生产任务，在夏季高温季节可进行培养室的维修维护及春季新建初代少量材料童化期的培养，减少试管苗的大量生产，以达到降低污染、减少生产成本的目的。

4.2 及时处理污染材料

通过对2种细菌和2种真菌污染菌生长结果的观察发现，细菌在培养3 h后就进入快速生长，但整体扩散面积小于真菌；真菌在培养3 d后进入快速生长，菌块很快布满整个培养基。对量少珍贵材料，在肉眼看到培养基表面有污染菌发生时，应立即不沾带培养基剪取茎尖，重新转接到干净培养基中，达到挽救材料、减少污染的培养目的。真菌污染材料要先于细菌材料转接。

4.3 定期杀菌和消毒

对规模化生产的培养室，接种室和培养室要定期熏蒸或喷雾，喷洒酒精或紫外线照射、臭氧机消毒。每天由专人监测培养室瓶苗，随时发现污染随时拿出培养室，连同试管污染材料一起灭菌，然后清洗。用于下代转接的试管苗，更应仔细挑选，杜绝带菌转接，避免污染菌的群体滋生造成大的经济损失。