circ_0000144靶向miR-502-5p调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡及迁移侵袭

储明慧，陈海银，张晓力

•KEYWORDS:retinoblastoma; circ_0000144; miR-502-5p; proliferation; apoptosis; migration; invasion

0引言

视网膜母细胞瘤是一种眼内恶性肿瘤，最常影响5岁以下的婴儿[1]。临床上视网膜母细胞瘤患者的典型特征是白瞳和斜视，活产儿发病率约为1/20 000[2]。尽管在过去的几十年中进行了广泛的研究，但视网膜母细胞瘤仍然难以诊断和治愈，在发展中国家，相关的死亡率高达约70%[3]。因此，阐明发病机制的分子机制对于视网膜母细胞瘤的早期发现和靶向治疗十分重要。环状RNA(circular RNA，circRNA)是单链，共价闭合的RNA分子，在多种类型的癌症(包括结直肠癌，肝细胞癌和胰腺癌)中表现出异常表达，可能成为各种癌症类型的诊断或治疗靶标[4-5]。属于一类短非编码RNA(19～22个核苷酸)的微小RNA(MicroRNA，miRNA)通过靶向影响细胞生理和疾病发展的多种分子来调控基因表达水平，在人类疾病中发挥重要作用[6]。研究表明，circ_0000144在胃癌组织和细胞中上调表达，敲低其表达可减缓胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭，加速细胞凋亡[7]。circ_0000144在膀胱癌组织中表达上调，下调其表达可抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭[8]。miR-502-5p在肾细胞癌组织中低表达，上调其表达可抑制肾细胞癌细胞的迁移和侵袭，circ_001842通过miR-502-5p参与肾细胞癌发病机制[9]。miR-502-5p在乳腺癌组织和细胞中下调表达，可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡[10]。但是，目前尚未探讨circ_0000144和miR-502-5p在视网膜母细胞瘤组织中的表达概况，以及其在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的生物学功能和机制。基于此，本研究旨在确定circ_0000144和miR-502-5p在视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移侵袭中所起的作用，以增进对视网膜母细胞瘤发病机制的理解。

1材料和方法

人视网膜母细胞瘤细胞株Y79购自中国科学院细胞资源中心(上海)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)购自美国Invitrogen，si-circ_0000144、si-NC、pcDNA、pcDNA-circ_0000144、miR-502-5p mimic、miR-502-5p inhibitor(anti-miR-502-5p)、mimic阴性对照miR-NC，inhibitor阴性对照anti-miR-NC购自上海GenePharma，M-MLV逆转录酶购自日本TaKaRa，SYBR Green assay试剂盒购自德国Roche，溴化噻唑蓝四氮唑(thiazole blue tetrazolium bromide，MTT)购自美国Life Technologies，膜联蛋白V(Annexin V)-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Becton Dickinson，RIPA缓冲液、二抗购自美国Cell Signaling Technology，二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific，ECL工作液购自南京Biochannel，荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国BioVision，兔单克隆细胞核相关抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)抗体、兔单克隆B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗体、兔单克隆Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)抗体、兔单克隆基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)-2抗体、兔单克隆MMP-9抗体、兔单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)购自美国Abcam公司。Multiscan MK3酶标仪购自美国Thermo Scientific，7500 PCR仪购自美国ABI，FACSCalbur流式细胞仪购自美国BD。

1.2方法

1.2.1实时定量聚合酶链反应检测circ_0000144和miR-502-5p表达按照制造商的说明，用TRIzol提取视网膜母细胞瘤组织和瘤旁组织的总RNA，使用M-MLV逆转录酶将其合成为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。使用SYBR Green试剂盒进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。circ_0000144和miR-502-5p，GAPDH(用于circRNA归一化)和U6(用于miRNA归一化)的引物如下：circ_0000144有义：5’-GAGTGTTGGCCTGTCCTCAA-3’和反义5’-TTGTGCCCAGTTGCCTGTAT-3’；GAPDH有义：5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’和反义：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’；miR-502-5p：5’-ATCCTTGCTATCTGGGTGCTA-3’和通用引物5’-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCC(T)-3’；U6有义：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和反义5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。使用2-ΔΔCt相对定量方法评估circ_0000144和miR-502-5p相对表达水平，其中ΔCt=Ct(靶标)-Ct(GAPDH/U6)。

1.2.2细胞培养与分组处理Y79细胞在含10% FBS的RPMI 1640培养基中和37℃、5% CO2培养箱中常规培养。将对数期Y79细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-circ_0000144组(转染si-circ_0000144)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-502-5p组(转染miR-502-5p mimic)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-circ_0000144组(转染pcDNA-circ_0000144)、si-circ_0000144+anti-miR-NC组(转染si-circ_0000144和anti-miR-NC)、si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组(转染si-circ_0000144和anti-miR-502-5p)。将Y79细胞以2×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，汇合至60%时，利用Lipofectamine 2000试剂进行上述转染。48h后，根据1.2.1中的qRT-PCR检测步骤，测定circ_0000144和miR-502-5p表达，并进行后续检测。

1.2.3MTT检测细胞增殖将转染48h后的Y79细胞接种到96孔板中，然后将细胞培养2d时，分别与100μL无菌MTT染料(0.5mg/mL)和150μL二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)孵育，15min后，于Multiscan MK3酶标仪测量490nm处的吸光度OD值。

1.2.4免疫印迹实验测定蛋白表达用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解转染的Y79细胞，并根据制造商的说明使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。然后将20μg蛋白质上样到10%凝胶上，使用SDS-PAGE分离并转膜。然后在室温下将膜用5%无脂牛奶封闭2h。随后，将膜与Ki-67、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9(均为1∶1 000)和GAPDH(参照，1∶2 500)的一抗一起孵育，在4℃过夜，与抗辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶2 000)室温下孵育2h。通过ECL工作液观察免疫反应带。

1.2.5流式细胞术分析细胞凋亡将转染48h后的Y79细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于500μL结合缓冲液中，在黑暗中添加5μL FITC和5μL碘化丙啶，并孵育15min。之后，通过FACSCalbur流式细胞仪测量Y79细胞凋亡。

1.2.6Transwell测定细胞迁移和侵袭分别使用24孔8μm的Transwell和Matrigel包被的Transwell进行迁移和侵袭分析。将约100μL Y79细胞溶液(包含5×105个细胞)铺板到Transwell插入物的顶部腔室中，然后将600μL 10% FBS培养基添加到下部腔室中。24h后，将迁移或侵袭的细胞用70%乙醇固定，用1%结晶紫染色，并在光学显微镜(200×放大倍数)下在5个视野中计数细胞数。

采用 HPS、APP、SS、PCV2、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA和CSFV的cDNA进行ddPCR特异性验证。结果表明：除了HPS特异性扩增，其他检测均为阴性，说明该方法特异性较好。

1.2.7生物信息学预测与双荧光素酶报告实验Circular RNA Interactome软件预测circ_0000144与miR-502-5p存在互补配对的核苷酸序列。将circ_0000144和miR-502-5p的预测结合位点片段和突变片段分别插入各自的荧光素酶载体，即报告载体野生型(WT)-circ_0000144和突变型(MUT)-circ_0000144。为了确定二者的结合，将miR-NC、miR-502-5p mimic与WT-circ_0000144、MUT-circ_0000144一起转染到Y79细胞中，48h后收集细胞并裂解，根据试剂盒说明书使用荧光素酶报告基因检测试剂盒和分析系统进行测定。

2结果

2.1circ_0000144和miR-502-5p在视网膜母细胞瘤组织中的表达31例视网膜母细胞瘤组织中circ_0000144表达量高于瘤旁组织，miR-502-5p表达量低于瘤旁组织，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 circ_0000144和miR-502-5p在视网膜母细胞瘤组织中的表达

2.2抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖的影响如表2、图1所示，si-circ_0000144组较si-NC组Y79细胞中circ_0000144表达量减少，OD值、Ki-67蛋白表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图1 Ki-67蛋白表达。

表2 抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖的影响

2.3抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的影响如表3、图2所示，si-circ_0000144组Y79细胞凋亡率高于si-NC组，Bcl-2蛋白表达量低于si-NC组，Bax蛋白表达量高于si-NC组，差异均有统计学意义(P<0.01)。

表3 抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的影响

图2 抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的影响 A：凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图。

2.4抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞迁移和侵袭的影响如表4、图3所示，si-circ_0000144组Y79细胞的迁移、侵袭细胞数比si-NC组少，并且MMP-2、MMP-9蛋白表达量比si-NC组低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞迁移和侵袭的影响 A：迁移侵袭相关蛋白表达；B：视网膜母细胞瘤Y79细胞的迁移、侵袭(结晶紫染色)。

表4 抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞迁移和侵袭的影响

2.5circ_0000144靶向调控miR-502-5p的表达Circular RNA Interactome软件预测出circ_0000144与miR-502-5p的靶向结合位点(图4)。miR-502-5p组WT-circ_0000144荧光活性低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.01)，miR-502-5p组MUT-circ_0000144荧光活性与miR-NC组差异无统计学意义(P>0.05，表5)。pcDNA-circ_0000144组(0.39±0.03)比pcDNA组(1.00±0.08)减少miR-502-5p表达量，si-circ_0000144组(3.01±0.22)比si-NC组(1.02±0.06)增加miR-502-5p表达量，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图4 circ_0000144的序列中含有与miR-502-5p互补的核苷酸序列。

表5 双荧光素酶报告实验

2.6miR-502-5p过表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响如表6、7，图5、6所示，miR-502-5p组较miR-NC组增加Y79细胞miR-502-5p表达量、凋亡率，减少OD值、迁移及侵袭细胞数，以及降低Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量，提高Bax蛋白表达量，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图5 miR-502-5p过表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡、迁移和侵袭的影响 A：细胞凋亡流式图；B：视网膜母细胞瘤Y79细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色)。

表6 miR-502-5p过表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

表7 miR-502-5p过表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

图6 增殖、凋亡、迁移侵袭相关蛋白表达。

2.7干扰miR-502-5p表达逆转了抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用如表8、9，图7、8所示，与si-circ_0000144+anti-miR-NC组比较，si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组Y79细胞miR-502-5p表达量、凋亡率减少，OD值、迁移及侵袭细胞数增加，Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高，Bax蛋白表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图7 干扰miR-502-5p表达逆转了抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡、迁移和侵袭的作用 A：细胞凋亡流式图；B：视网膜母细胞瘤Y79细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色)。

表8 干扰miR-502-5p表达逆转了抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用

表9 干扰miR-502-5p表达逆转了抑制circ_0000144表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的作用

图8 增殖、凋亡、迁移侵袭相关蛋白表达。

3讨论

在目前的研究中，我们确定circ_0000144在视网膜母细胞瘤组织中上调。功能研究表明，siRNA对circ_0000144的下调减弱了视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖、迁移和侵袭特性，并加速细胞的凋亡。而增殖蛋白Ki-67、抗凋亡蛋白Bcl-2、转移蛋白MMP-2、MMP-9的上调，以及促凋亡蛋白Bax的下调也证明了这一结果。在既往的报道中，hsa_circ_0000144的表达在胃癌细胞系中上调，可促进胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭[11]。circ_0000144在甲状腺癌组织和甲状腺癌细胞系中的表达显著升高，其高表达与患者的肿瘤大小、患者的肿瘤大小和淋巴结转移显著相关。敲除circ_0000144可抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。这些与本研究的结果相吻合，证实了circ_0000144在体外可促进视网膜母细胞瘤细胞增殖和转移，以及减少细胞凋亡，这为circ_0000144作为视网膜母细胞瘤致癌性circRNA提供了新的证据。

本研究qRT-PCR分析表明，miR-502-5p在视网膜母细胞瘤组织中显著下调，表明其可能具有抑癌作用。然而miR-502-5p是否在视网膜母细胞瘤中起作用仍然未知。先前的研究表明，miR-502-5p与肿瘤的生长和转移有关，例如You等[13]报道，与邻近的正常组织相比，胃癌肿瘤组织中的miR-502-5p明显下调，miR-502-5p的过表达在体外减弱了胃癌细胞的增殖，迁移/侵袭并诱导了G1期阻滞，并且抑制了体内肿瘤的生长和转移。Ying等[14]揭示miR-502-5p在膀胱癌中被下调，miR-502-5p的过表达在体外抑制膀胱癌细胞增殖和迁移。Peng等[15]鉴定了胃癌组织和细胞中低表达的miR-502-5p，发现miR-502-5p通过靶向SP1来调节胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭而充当抑癌基因。本研究观察到，miR-502-5p过表达时，Y79细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著增加，细胞增殖、迁移及侵袭能力、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量则显著减少。说明与既往报道[13-15]一致，miR-502-5p是视网膜母细胞瘤的肿瘤抑制剂，可以有效抑制视网膜母细胞瘤的发生发展。

越来越多的证据表明，某些circRNA可以通过充当miRNA海绵来调节miRNA，并在转录控制中发挥重要作用[16]。例如，胃癌中circ_0032627可以充当miR-502-5p的海绵[17]。肝细胞癌中circ-ZNF652可以海绵化miR-203[18]。本实验中，Circular RNA Interactome软件预测到circ_0000144与miR-502-5p的靶向结合，随后的双荧光素酶报告实验证实circ_0000144靶向调控miR-502-5p的表达。且上调circ_0000144时，miR-502-5p表达被抑制，下调circ_0000144时，miR-502-5p表达被促进，说明circ_0000144可以负调控miR-502-5p的表达。干扰miR-502-5p表达后，抑制circ_0000144表达对Y79细胞增殖、迁移和侵袭、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的抑制作用被逆转，其对细胞凋亡、Bax蛋白表达的促进作用也被逆转。这些结果提示，circ_0000144通过负调控miR-502-5p参与视网膜母细胞瘤细胞恶性进展。

总之，本研究表明，circ_0000144在视网膜母细胞瘤组织中高表达，circ_0000144的抑制通过调节miR-502-5p来减轻视网膜母细胞瘤的进展。当前的研究强调了circ_0000144作为肿瘤启动子在视网膜母细胞瘤中的潜在作用，因此circ_0000144是视网膜母细胞瘤治疗的潜在靶点。