不同试剂盒检测急性肝胰腺坏死病比对与分析

莫钻兰 李 敏 黄炳炽 彭家杰 洪伟彬 胡健声 黄洁莹

广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523000

急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic ne⁃crosis disease，AHPND），因其主要发生于虾苗放养后7～30 d，又名早期死亡综合征（early mortality syn⁃drome，EMS）[1-2]，死亡率可达100%[3]，是近年来出现的一种新型致命性的细菌性疾病，主要危害凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）和中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）。该病最早于2010年被发现，近年来，马来西亚、越南、泰国、菲律宾、墨西哥等国家相继有所报道[4-9]，使全球对虾养殖业每年损失近10 亿美元[10]，严重影响了对虾产业的发展。

血清学分型、生化鉴定是检测鉴定细菌的经典方法，郭书林等[11]研究发现，MALDI-TOF-MS 检测效率高于生化鉴定方法，与PCR 结合使用更有利于急性肝胰腺坏死病的诊断和监测。随着检测技术的不断发展，越来越多商品化的实时荧光定量PCR检测试剂盒被研发出来。本研究就本实验室参加的急性肝胰腺坏死能力测试的样品来对比和分析不同商品化荧光定量PCR 试剂盒检测结果的一致性。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）样品。此次待检样品和阳性标准物质均由中国水产研究院黄海水产研究所（以下简称黄海所）提供。8 份样品均保存于95%乙醇中，编号为107873、107231、107122、107512、107243、107235、107431、107233。

2）试剂。海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（批号：S8107）购自天根；引物探针（批号：111516527）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；预混液（批号：AK11116A）购自Takara；3 种商品化的对虾肝胰腺坏死荧光PCR 检测试剂盒分别来自不同生产厂家：A（批号：200417）、B（批号：67054）、C（批号：JC0003202006）。

3）仪器设备。生物安全柜，高速离心机，荧光PCR仪。

1.2 方 法

1）本次能力测试要求的检测方法。按照黄海所下发的《病原测试项目作业指导书》，依据SC/T 7233-202X《急性肝胰腺坏死病诊断规程》（报批稿）进行试验分析。

①核酸提取。使用天根DNA 提取试剂盒，依其说明书提取急性肝胰腺坏死病毒的核酸。

②qPCR 检测。按表1 中引物和探针配置qP⁃CR 反应体系，分装到PCR 管中，分别加入样品模板DNA，阴性对照和阳性对照。混匀离心后，置于荧光定量PCR 仪中。按表1 中的反应程序进行扩增，25 µL PCR 反 应 体 系，包 括：2×PCR Premix（Probe qPCR）12.5 µL、引物VpPirA-F（10 mol/L）0.75 µL、引物VpPirA-R（10 mol/L）0.75 µL、Taq⁃man Probe（10 mol/L）0.25 µL、模板DNA（浓度：50～100 ng/µL）1 L、灭菌双蒸水9.75 µL。结果判定标准详见表2。

表1 qPCR检测的引物、探针、反应程序和时间

表2 试验结果判定标准

2）商品化的急性肝胰腺坏死实时荧光定量PCR 检测。以本次参测盲样为样品，从市场上选取3家不同厂家生产的实时荧光定量PCR 检测试剂盒检测（由A、B、C 代替）进行试验与分析，3 种试剂盒的试验成立标准、结果判定标准各不相同（表3）。按照各自试剂盒说明书配制荧光PCR 反应体系，依次加入阴性对照、样品核酸和阳性对照，加样后及时盖紧管盖，做好标记，混匀后离心，按照各自的反应程序扩增。

表3 不同试剂盒的反应体系、反应时间、试验成立和结果判定标准

2 结果与分析

2.1 核酸检测结果

依据《SC/T 7233-202X》（报批稿）方法对样品进行试验分析。如图1所示，阳性质控Ct值为22.65且有典型的S 型曲线，阴性对照无Ct 值，试验成立。样 品107243、107431、107235、107231、107873 在FAM 通道有典型的扩增曲线且Ct 值分别为15.09，28.14，32.64，33.15 和33.5，样 品107122、107233、107512 均无Ct 值。因此，可判样品107243、107431、107235、107231、107873 为Vahpnd 核酸阳性，样品107122、107233、107512 为Vahpnd 核酸阴性，检测结果为满意。

图1 Vahpnd的扩增曲线图

2.2 商品化的急性肝胰腺坏死实时荧光定量PCR结果

各试验阴、阳对照符合说明书的试剂成立标准，试验均成立。但是，只有A、C 与对比试验结果一致，B均未检出阳性盲样（图2）。如表3所示，C试剂的反应时间较A 略快，分别是56 min 和66 min。设定相同阈值时，A 试剂检测的5 个阳性样品的Ct值要略小于C试剂（表4）。

图2 不同试剂的扩增曲线图

表4 设定相同阈值时，A、C试剂检测出的阳性样品的Ct值

3 讨 论

本次能力验证的检测依据《SC/T 7233-202X《急性肝胰腺坏死病诊断规程》（报批稿）》中可以采用商品化探针法qPCR，但也同时强调的是需要有同等效果。本次试验发现，市场上3 种商品化荧光定量qPCR 试剂盒，A和C的检测结果符合能力验证的结果，因此，实验室在选用商品化试剂盒时需要做试剂比对，更有利于确保检测数据的准确性。

本次试验设置相同的阈值为20，A 试剂的Ct 值偏小。研究发现：Ct 值与该DNA 模板的起始拷贝数的对数呈反比[12]，但是，A 试剂加入的模板量大于C 试剂，因此，不能判断A 试剂的灵敏度高于C 试剂。对比A、C试剂扩增曲线图，发现A 试剂在40个循环后还出现了缓慢增长的趋势，C 试剂更接近S形，可推测为A 试剂的反应液还有较充足的离子、酶、能量等。这是因为随着PCR 循环的增多，产物增长的速度逐渐减缓，待所有的dNTP、酶等被基本用尽后，扩增曲线就进入了平台期[13]。结合表1 和表3，标准方法的反应时间是60 min，A 试剂的反应时间为66 min，C 试剂的反应时间为56 min。在实际工作中，如果想尽快得到检测结果，可选C试剂。