壳寡糖通过抑制白细胞介素-1β的生物学活性减缓由脂多糖诱导的奶牛外周血单个核细胞氧化应激损伤

齐敬宇 郑亚光 郝 颖 赵艳丽 郭晓宇 郭咏梅 史彬林 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区高校动物营养与饲料科学重点实验室，呼和浩特 010018)

奶牛泌乳期高强度的代谢以及泌乳早期能量负平衡引起的脂肪动员加强均会导致体内自由基蓄积过多，从而造成免疫和抗氧化应激功能及生产性能下降，尤其是高产奶牛[1]。本课题组前期研究结果得出高产奶牛的抗氧化指标如总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性显著降低[2]。一氧化氮(NO)是具有简单结构和小分子量的活性氮簇(RNS)自由基，其在机体中具有双向调节的功能。研究表明，巨噬细胞产生的NO在体内和体外均有神经信号传递功能、抗菌和免疫作用。然而，NO的过量产生对细胞具有毒害作用，使奶牛乳腺上皮细胞产生明显的氧化应激反应[3]。外周血单个核细胞(PBMC)是一类重要的免疫效应细胞，能够反映机体感染及疾病的发生，其抗氧化应激能力与奶牛的抗氧化和免疫功能密切相关[4]。郑亚光等[5]研究表明，NO过量会明显引起奶牛PBMC的氧化应激。因此，抑制奶牛PBMC中NO的蓄积是提高奶牛抗氧化能力、降低氧化损伤的主要途径之一。

壳寡糖(COS)是一种由β-(1→4)-糖苷键连接的二氨基葡萄糖低聚物，具有水溶性、无细胞毒性、易被肠道吸收等特点，它是通过将壳聚糖进行酸水解和酶降解得到的[6]。COS具有许多生物学活性，如抗炎、抗氧化和免疫刺激等，而且COS与壳聚糖具有相似的生物学活性和理化特性[7]。研究表明，COS对脂多糖(LPS)诱导的炎症反应具有抑制作用，可以减少炎症因子白细胞介素-6(IL-6)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和NO的释放和表达[8]。本课题组前期研究表明，COS对过量NO诱导的PBMC氧化应激具有减缓作用[9]；COS对PBMC抗氧化功能的促进作用以及对炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)生物学活性的抑制作用呈剂量依赖性，可降低iNOS的含量和基因表达，进而降低NO的生成[10]，但其确切机制尚不清楚。iNOS在正常细胞中表达量极少，但在IL-1β等炎症因子刺激下持续表达，进而使NO过量生成，因此使机体产生氧化应激[11]。白细胞介素-1(IL-1)是多种器官炎症和组织损伤的重要介导剂，IL-1家族主要由2种刺激剂[白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β]、2种受体[Ⅰ型白细胞介素-1受体(IL-1RⅠ)、Ⅱ型白细胞介素-1受体(IL-1RⅡ)]以及1种特异性受体拮抗剂[白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)]组成[12]。当IL-1α或IL-1β与白细胞介素-1受体(IL-1R)结合可以激活相关信号通路。LPS是一种来源于革兰氏阴性菌的内毒素，是IL-1β等炎症介质的诱导剂[13]。研究表明，由LPS引起的小鼠氧化应激反应，通过注射IL-1ra进行治疗，成功减少了IL-1β表达，进而显著降低了炎症反应[14]。Pang等[15]的研究也表明，0.1 mg/kg的IL-1ra可以显著减少由LPS诱导的成年大鼠的炎症反应。这些研究结果说明IL-1ra可以通过阻断IL-1信号通路保护细胞免受氧化损伤。因此推断COS对PBMC氧化应激损伤的预保护作用可能与其降低了IL-1β的表达进而降低了NO的生成有关，但确切研究尚未见报道。为了进一步探究COS减缓奶牛PBMC氧化损伤机制是否与IL-1β有关，本文以LPS作为外源诱导剂，刺激细胞氧化应激，以IL-1ra阻断IL-1β的生物学活性，探讨COS对LPS诱导的奶牛PBMC氧化应激损伤的预保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PBMC通过采集奶牛外周血分离培养制备；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；COS购自济南海得贝海洋生物工程有限公司，脱乙酰度90.27%，相对分子质量<3 000；IL-1ra(货号AF-480-SP)购自RD公司；台盼蓝、牛PBMC分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；LPS购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国HyClone公司。

1.2 试剂配制

LPS工作液的配制方法：取1 mg LPS粉末溶于1 mL超纯水中，配制成浓度为1 mg/mL的LPS一级母液，继续用RPMI-1640培养基稀释10倍配制成浓度为100 μg/mL的LPS二级母液。试验开始前，吸取1 mL二级母液溶解于9 mL RPMI-1640培养基配制成终浓度为10 μg/mL的LPS工作液。

IL-1ra工作液的配制方法：取25 μg IL-1ra溶于250 μL高压超纯水中，配制成浓度为100 μg/mL的一级母液，继续按照试验要求用RPMI-1640培养基稀释一级母液，配制成终浓度为1 ng/mL的IL-1ra工作液。

COS工作液的配制方法：准确称取0.16 g COS溶解于10 mL高压超纯水中，配制成浓度为16 mg/mL的COS一级母液。将COS一级母液按照试验要求用RPMI-1640培养基稀释，配制成终浓度为160 μg/mL的COS工作液。

上述LPS、IL-1ra、COS工作液均通过0.22 μm的过滤器过滤，并避光保存。

1.3 PBMC的分离与培养

本试验采用单次密度梯度离心分离法培养PBMC，分离培养方法参照郑亚光等[9]报道的方法进行。对健康奶牛尾静脉采血后12 h内进行PBMC分离，简要步骤如下：将血液样本缓慢加入到盛有牛PBMC分离液的离心管中，血液在上方，血液与分离液比例为1∶1，400×g离心40 min(离心机温度要低于25 ℃，细胞获得率高低与室温有关，超过25 ℃时细胞获得率降低)，离心后由上至下分为4层，依次为血浆层、环状乳白色PBMC层、透明分离液层和红细胞层。吸取PBMC层，并用PBS重悬清洗细胞，250×g离心10 min后弃上清，重复清洗细胞2次后，将细胞接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养68 h后将250×g离心15 min后收集细胞进行后续试验。在细胞培养结束前4 h取部分细胞用台盼蓝进行染色并计数活细胞数(应在95%以上)。

1.4 试验设计

采用完全随机试验设计，将上述分离培养得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于24孔板中，并随机分为8个组，每组6个重复。第1组为对照组(CON组，-COS-IL-1ra-LPS)，利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞72 h；第2组为COS组(+COS-IL-1ra-LPS)，利用只含COS、不含LPS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞72 h；第3组为LPS组(-COS-IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞48 h，后添加LPS工作液继续培养细胞24 h；第4组IL-1ra组(-COS+IL-1ra-LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞42 h，后添加IL-1ra工作液继续培养细胞30 h；第5组COS+IL-1ra组(+COS+IL-1ra-LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞42 h，后添加IL-1ra工作液继续培养细胞30 h；第6组COS+LPS组(+COS-IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞48 h，后添加LPS工作液继续培养细胞24 h；第7组IL-1ra+LPS组(-COS+IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞42 h，后添加IL-1ra工作液培养细胞6 h，最后添加LPS工作液继续培养细胞24 h；第8组COS+IL-1ra+LPS组(+COS+IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培养基培养细胞42 h，后添加IL-1ra工作液继续培养细胞6 h，最后添加LPS工作液继续培养细胞24 h。试验设计详见图1。COS、LPS和IL-1ra工作液浓度参照本课题组前期研究结果分别确定为160 μg/mL、10 μg/mL和1 ng/mL，培养结束后收集细胞和培养液，测定相关指标。

LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；IL-1ra：白细胞介素-1受体拮抗剂 interleukin-1 receptor antagonist；COS：壳寡糖 chitosan。

1.5 样品采集与处理

细胞培养液：将分离培养得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于96孔板中(200 μL/孔)，按照试验设计要求处理结束后，反复吹打混匀每组的细胞培养液，分别收集到1.5 mL Eppendorf离心管中，4 ℃、1 000×g离心10 min，收集上清液用于NO、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量与iNOS、活性氧簇(ROS)、硫氧化蛋白还原酶(TrxR)活性和T-AOC的测定。

细胞裂解液：将分离培养得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照试验设计要求处理结束后，反复吹打混匀收集细胞悬浮液到1.5 mL Eppendorf离心管中，加1 mL PBS清洗2遍，加入细胞裂解液，置于4 ℃冰箱中裂解30 min，4 ℃、10 000×g离心10 min，收集上清液于新的离心管中，用于T-SOD、GPx、过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量的测定。

细胞RNA提取样品：将分离培养得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照试验设计要求处理结束后，反复吹打混匀收集细胞悬浮液到1.5 mL Eppendorf离心管中，250×g离心10 min后弃上清，加1 mL PBS重悬细胞，离心弃上清，清洗2遍，加1 mL Trizol Plus于冰上反复吹打裂解细胞，用于后续RNA提取。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 抗氧化指标、iNOS与ROS活性以及NO与炎症因子含量

T-SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定、CAT活性采用比色法测定、GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，T-AOC采用钼酸铵显色法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量与iNOS、ROS、TrxR活性均采用双抗体夹心法测定，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，试剂盒均购自R&D公司。

1.6.2 抗氧化酶、炎症因子及核因子-κB(NF-κB)p65和核因子-E2相关因子2(Nrf2)的mRNA相对表达量

抗氧化酶TrxR和GPx1，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS及Nrf2、NF-κBp65的mRNA相对表达量采用TB Green实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术进行测定。以18S、β-肌动蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，对RT-qPCR的结果进行标准化，使用2-△△Ct计算目的基因的mRNA相对表达量。

1.7 数据统计与分析

试验数据采用SAS 9.0统计软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序对所有处理进行显著性检验和多重比较(Duncan氏法)。以P≤0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 抗氧化指标、iNOS与ROS活性以及NO与炎症因子含量

由表1可知，与CON组相比，PBMC的GPx、T-SOD、CAT和TrxR活性及T-AOC在LPS组均显著降低(P≤0.05)，而在COS组、COS+IL-1ra组均显著升高(P≤0.05)，但COS组与COS+IL-1ra组、IL-1ra组与CON组之间无显著差异(P>0.05)。与LPS组相比，IL-1ra+LPS组和COS+LPS组的上述抗氧化指标均显著升高(P≤0.05)，但这些指标在IL-1ra+LPS组与COS+LPS组、COS+IL-1ra+LPS组与COS+LPS组间均无显著差异(P>0.05)。

表1 COS和IL-1ra对LPS损伤的PBMC抗氧化酶指标、iNOS与ROS活性以及炎症因子与NO含量的影响Table 1 Effects of COS and IL-1ra on antioxidant indexes, iNOS and ROS activities， inflammatory factors and NO contents in PBMC damaged by LPS

炎症因子含量与上述抗氧化指标的变化规律呈相反的趋势。与CON组相比，LPS组的IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高(P≤0.05)，COS组与IL-1ra组间上述指标均无显著差异(P>0.05)。与LPS组相比，IL-1ra+LPS和COS+LPS组的上述指标均显著降低(P≤0.05)，但IL-1ra+LPS组与COS+LPS组间无显著差异(P>0.05)。COS+IL-1ra组与IL-1ra组相比，COS+IL-1ra+LPS组与COS+LPS组相比，上述指标均无显著差异(P>0.05)。MDA和NO含量、iNOS和ROS活性的变化趋势与上述指标呈相似的变化规律。

2.2 抗氧化酶、炎症因子及NF-κB p65和Nrf2的mRNA相对表达量

由表2可知，与CON组相比，COS组GPx1和TrxR的mRNA相对表达量显著升高(P≤0.05)，LPS组则显著降低(P≤0.05)，而IL-1ra组与CON组间无显著差异(P>0.05)。与LPS组相比，IL-1ra+LPS组和COS+LPS组GPx1和TrxR的mRNA相对表达量均显著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS组与COS+LPS组间无显著差异(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS组与COS+LPS组相比，上述基因的mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。与CON组相比，LPS组Nrf2的mRNA相对表达量显著降低(P≤0.05)，但COS组、IL-1ra组无显著变化(P>0.05)。与LPS组相比，IL-1ra+LPS组和COS+LPS组Nrf2的mRNA相对表达量均显著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS组较COS+LPS组显著降低(P≤0.05)。COS+IL-1ra组与IL-1ra组相比，Nrf2的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS组与COS+LPS组相比，Nrf2的mRNA相对表达量显著降低(P≤0.05)。

表2 COS和IL-1ra对LPS损伤的PBMC抗氧化酶、炎症因子、NF-κB p65和Nrf2的mRNA相对表达量的影响Table 2 Effects of COS and IL-1ra on mRNA relative expression levels of antioxidant enzymes, inflammatory factors, NF-κB p65 and Nrf2 in PBMC damaged by LPS

炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相对表达量与抗氧化酶呈相反的变化规律。与CON组相比，LPS组IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相对表达量显著升高(P≤0.05)，但COS组、IL-1ra组无显著变化(P>0.05)。与LPS组相比，IL-1ra +LPS组、COS+LPS组上述基因的mRNA相对表达量显著降低(P≤0.05)，但IL-1ra+LPS组与COS+LPS组间无显著差异(P>0.05)。COS+IL-1ra组与IL-1ra组相比，COS+IL-1ra+LPS组与COS+LPS组相比，上述指标均无显著差异(P>0.05)。NF-κBp65的mRNA相对表达量的变化与上述炎症因子呈相似的变化规律。

3 讨 论

3.1 COS对LPS诱导的奶牛PBMC氧化应激损伤具有减缓作用

抗氧化酶活性和炎症因子含量的变化是反映细胞是否受到氧化损伤的重要指标[16]。在一定范围内，抗氧化酶活性越高，说明机体抗氧化能力越强；炎症因子含量在一定范围内升高，免疫功能增强，但过度升高则表现为免疫功能紊乱，炎症反应增强。LPS是一种来源于革兰氏阴性菌的内毒素，是IL-1β等炎症介质的诱导剂，例如，LPS会诱导鼠产生炎症因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，进而引发机体发生氧化应激[13]。IL-1β等炎症因子也刺激细胞中iNOS持续表达，进而使NO过量生成，使机体产生氧化应激[11]。研究表明，LPS可刺激奶牛乳腺上皮细胞中IL-1β含量显著增加，进而导致氧化应激[17]。因此本试验利用LPS在体外损伤模型中诱导IL-1β产生。COS是自然界中唯一天然存在的带正电荷的碱性多糖，并因其强大的抗氧化能力可以作为天然的抗氧化剂。研究表明，给大鼠饲喂COS可以通过显著提高抗氧化酶活性减缓由LPS引起的氧化损伤[18]。本试验结果表明，LPS诱导了IL-1β等炎症因子的释放，引起iNOS的表达与NO含量的升高，因此降低了抗氧化酶的活性，升高了MDA含量，诱导了奶牛PBMC的氧化应激；COS逆转了LPS引起的抗氧化酶活性及其基因表达的降低，即COS对LPS引起的奶牛PBMC氧化应激损伤具有缓解作用。

3.2 COS通过抑制IL-1β的生物学活性减缓LPS诱导的奶牛PBMC氧化应激损伤

IL-1是典型的促炎细胞因子，在先天免疫反应中起着重要作用，参与一些炎性疾病的发病机制[19]。在机体处于健康状态下，IL-1在血液单核细胞中的含量很低或者不存在，但在疾病状态下其含量显著增加[20]。IL-1β是IL-1家族重要的促炎细胞因子，可诱导刺激iNOS的基因和蛋白大量表达，进而催化生成过量的NO[11]。IL-1β主要由单核细胞和巨噬细胞产生，还可以由中性粒细胞产生，可以被IL-1ra所拮抗[21]。IL-1ra已在临床医学上广泛用于治疗多种自发性免疫性疾病[12]。IL-1ra是第1个被发现的特异性抑制剂，它不能直接与IL-1结合，而是通过与IL-1R结合后具有很强的亲和力，从而无法激活细胞活性，抑制IL-1的生物学活性[12]。本研究表明，IL-1ra单独处理PBMC并未对细胞的抗氧化酶活性和炎症因子含量产生显著影响，说明其对PBMC没有副作用。IL-1ra作为炎症因子的受体拮抗剂，对新生大鼠由LPS引起的氧化应激和促炎效应有保护作用[14]。LPS可诱导PBMC发生氧化应激，细胞内氧化还原遭到破坏，而抑制IL-1β的生物学活性对减缓细胞氧化损伤至关重要[4]。本研究得出了类似的结果，结果显示，单一添加LPS诱导了IL-1β产生，引起iNOS活性以及NO含量升高，导致氧化应激，降低了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表达；但IL-1ra+LPS处理逆转了上述指标的变化，减缓了细胞氧化应激的发生，进一步说明了IL-1β是LPS诱导细胞发生氧化应激的关键因素；与LPS处理相比，COS+LPS处理降低了IL-1β、NO含量以及iNOS活性，升高了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表达量，缓解了细胞的氧化应激损伤，说明COS处理与IL-1ra处理对LPS诱导的氧化应激损伤具有相似的预保护作用。因此，本试验进一步得出，COS通过抑制IL-1β的生物学活性对LPS诱导的氧化应激损伤发挥预保护作用，进而减缓了氧化应激的发生。

研究指出，诱导NF-κB信号通路的活化可以促进下游基因iNOS以及炎症因子的表达，进而导致NO等自由基大量释放[10]。COS可以显著抑制MIN6细胞中NF-κBp65的基因与蛋白的表达，降低iNOS的活性及其基因表达，抑制NO的生成[22]。在人乳腺癌细胞中的研究表明，GPx1可以抑制NF-κB的上游激酶核因子-κB抑制蛋白(IκB)，使NF-κB p65磷酸化[23]。苏芮[24]研究报道，在奶牛乳腺上皮细胞中沉默GPx1基因的表达，会激活NF-κB信号通路，增加下游促炎细胞因子的活性及基因表达，刺激iNOS的活性及其基因表达与NO含量增加，使细胞抗氧化能力下降。石惠宇等[17]研究表明，通过激活Nrf2信号通路可增强奶牛乳腺上皮细胞GPx1基因的表达，进而显著抑制NF-κB信号通路的活性。研究表明，激活的Nrf2增加其下游抗氧化系统中GPx、TrxR和SOD等基因表达，进而引起NF-κB信号通路磷酸化水平的降低，减少了自由基生成并减弱了脂质过氧化反应程度，从而增加细胞的抗氧化功能[25]。本研究结果表明，LPS诱导奶牛PBMC氧化应激的同时，Nrf2及其靶基因GPx的活性降低，NF-κB p65及其下游炎症因子IL-1β和iNOS基因的表达均上调，当添加COS或IL-1ra处理后会引起了上述指标呈相反的变化，提示COS可能通过上调Nrf2的活性，增强GPx活性，对NF-κB信号通路产生抑制作用，减少IL-1β的释放，进而降低NO的生成，减缓细胞的氧化应激损伤。COS减缓LPS诱导的奶牛PBMC氧化应激损伤的作用机制如图2所示。然而，目前相关研究甚少，确切机制有待进一步探讨。

虚线代表需要进一步验证的内容。“+”代表促进作用，“-”代表抑制作用。The dotted lines represent content that requires further validation.“+” represents promotion, and “-” represents inhibition.

4 结 论

LPS诱导的奶牛PBMC氧化应激引起IL-1β含量增加，COS通过抑制NF-κB信号通路活性来减少IL-1β的释放，进而降低NO的生成，从而发挥其减缓氧化应激损伤的功能。