左旋紫草素对大鼠重症急性胰腺炎并发急性心肌损伤的保护作用研究*

张 媛,关 静，蒋 锐，肖雯婧，呼永河，侯 君△

1.西部战区总医院 放射诊断科(成都 610083)；2.西部战区总医院 药剂科(成都 610083)；3.四川省中医骨科与运动康复临床医学研究中心 (成都 610083)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 为临床常见急重症，具有发病急、病死率高、并发症凶险的特点，易导致心、肺、肝等多器官严重缺血、缺氧，甚至出现成人呼吸窘迫综合征、急性肝功能衰竭、急性肾功能衰竭及休克[1-3]。已有研究[4]表明，SAP大鼠存在心脏结构和功能改变，证明SAP可并发心肌损伤。SAP可引起炎症因子的大量释放，而炎症因子的释放与心肌功能障碍发生有关[5]。 炎性小体(NLRP3)通过激活效应蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)，促进白介素1-β(IL-1β)成熟与分泌，是固有免疫的重要构成，主要参与炎症反应。主流研究[6-7]认为，NLRP3 的激活与活性氧簇(ROS)的产生密切相关。研究SAP并发急性心肌损害(acute myocardial injury, AMI)具体机制对临床救治此类患者具有重要意义。

左旋紫草素是从紫草科天然植物紫草中提取的一类萘醌化合物，具有抗炎、抗真菌和抗肿瘤等作用[8-10]。课题组前期实验[10]结果表明，左旋紫草素可抑制高糖心肌细胞坏死性凋亡，但其减轻SAP并发AMI的作用尚未见报道。本研究主要观察SAP大鼠并发AMI时NLRP3炎性小体相关蛋白的表达，并探讨左旋紫草素减轻SAP并发AMI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肌酸激酶同Ⅰ酶(CK-MB)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；IL-1β酶联免疫吸附剂测定试剂盒、左旋紫草素、二氢乙锭(DHE)、Caspase-1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及β-actin一抗购自美国Sigma公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗、ECL化学发光底物、BCA蛋白定量盒及细胞裂解液购自武汉碧云天公司；L-精氨酸购自北京索莱宝科技有限公司；OCT包埋剂购自日本SAKURA公司。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠24只，体重220～240 g，购于成都达硕实验动物有限公司。

1.3 造模及给药方法

大鼠饲养于标准温度、湿度和空气清洁度的动物房内，造模前12 h禁食、不禁水。SAP造模方法：每只大鼠按照3.2 g/kg体重腹腔注射250 g/L的L-精氨酸2次，每次间隔1 h，第2次注射24 h后SAP模型造模成功。造模成功的SAP模型大鼠作为SAP模型组，假手术组大鼠腹腔注射等量生理盐水，左旋紫草素干预组为SAP小鼠腹腔注射20 mg/kg左旋紫草素。每组于造模后24 h收集血液、胰腺及心脏组织标本。

1.4 酶联免疫吸附剂测定法

大鼠心脏取血2 mL，以离心半径7 cm，转速3 000 r/min，离心10 min后取上清，按酶联免疫吸附剂测定法试剂盒说明书检测CK-MB、TNF-α、IL-1β水平。

1.5 HE染色

大鼠切取小部分左室心肌及胰腺，4%多聚甲醛固定、各浓度酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，观察心肌及胰腺结构变化。

1.6 心肌ROS检测

大鼠切取左室心肌组织置入OCT包埋剂中，冰冻切片(厚度10 μm)，放置于含PBS的DHE (1.6 μmol/L) 溶液中37 ℃避光孵育30 min，在488 nm激发光，560～660 nm滤波处，使用激光共聚焦显微镜观察并照相。

1.7 蛋白质印迹技术

大鼠左室心肌经RIPA裂解液提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜30 min。5% 脱脂奶粉封闭2 h，分别加入Caspase-1、NLRP3、ASC以及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜；TBST洗膜，二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL显色，Image J 图像分析软件对曝光图像进行光密度分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色

2.1.1 胰腺组织 假手术组胰腺结构正常；SAP模型组胰腺间质水肿，可见一定炎性细胞表达，小叶轮廓被破坏类似孤岛样分布；左旋紫草素干预组胰腺β细胞水肿程度较SAP模型组明显降低，炎性细胞减少，胰腺结构趋于正常(图1)。

图1 各组胰腺 HE染色(×400)

2.1.2 心肌组织 假手术组心肌结构正常；SAP模型组心肌肿胀明显，肌纤维排列紊乱，肌膜破裂；左旋紫草素干预组较SAP模型组心肌肿胀程度减轻，横纹较心肌纤维清晰，细胞排列结构趋于正常(图2)。

图2 各组心肌HE染色(×400)

2.2 大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-1β水平

SAP模型组大鼠血清CK-MB、TNF-α及IL-1β水平较假手术组明显增高 (P<0.05) ；左旋紫草素干预组CK-MB、TNF-α、IL-1β水平较SAP模型组明显下降 (P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠造模后 24 h 血清 CK-MB、TNF-α 、IL-1β水平变化比较

2.3 大鼠心肌Caspase-1、NLRP3、ASC蛋白水平

蛋白质印迹技术结果显示，SAP模型组大鼠心肌NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表达量较假手术组明显增高(P<0.05)；左旋紫草素干预组大鼠心肌 NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表达量明显低于SAP 模型组(P<0.05) (图 3)。

图3 各组心肌Caspase-1、NLRP3及ASC表达

2.4 心肌ROS含量

与假手术组相比，SAP模型组心肌组织氧化应激反应增强，表现为DHE的荧光信号放大(P<0.05)；左旋紫草素干预组能明显减少心肌组织内ROS堆积(P<0.05)(图4)。

图4 各组心肌ROS水平(×400)

3 讨论

当心肌细胞膜完整性遭到破坏时，胞质内游离的CK-MB在3～6 h后可在外周血中检测出异常[11]，使SAP从最初的局部胰腺炎症扩展为全身炎症反应，包括心脏、肝脏、肾脏等。心肌炎症反应是SAP并发AMI的最重要的病理表现之一。SAP早期，急性炎症因子TNF-α足量产生并迅速升高，通过多种途径加重心肌损伤，比如刺激血管内皮细胞表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)分泌、促进内皮-白细胞黏附分子(ELAM-1)表达、诱导IL-6产生发挥细胞因子放大效应、通过与其受体结合激活NF-KB通路等[12-14]。本研究结果表明，SAP早期存在较明显的AMI，血清心肌特异性指标CK-MB浓度升高，心肌细胞肿胀和间质水肿程度增加。经左旋紫草素干预治疗后，SAP血清TNF-α水平和CK-MB浓度降低，同时也减轻了大鼠心肌损害的形态学改变，心肌细胞肿胀和间质水肿程度得到明显改善，阻断了这一炎症起始因子的破坏作用，保护了SAP并发AMI导致的急性心肌损伤，差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明，SAP时心肌组织活性氧ROS的产生明显增加，伴随NLRP3炎性小体复合物中Caspase-1 活性及其下游产物IL-1β的含量明显升高，表明NLRP3炎性小体在SAP并发AMI中扮演重要的作用；同时蛋白质印迹技术实验结果也证实,NLRP3炎性小体相关蛋白表达均升高，NLRP3炎性小体被过度活化，上述结果均表明ROS是NLRP3炎性小体激活调控的核心，过量的ROS可直接激活NLRP3炎性小体，是炎症相关疾病发生的关键环节[15]，调控ROS有望成为控制NLRP3炎症小体激活和治疗炎症相关疾病的重要靶点。

综上所述，左旋紫草素减轻SAP 大鼠并发AMI的作用可能是通过抑制NLRP3炎性小体过度活化，降低心肌炎症反应来实现，本研究为左旋紫草素可能成为NLRP3炎性小体的抑制剂奠定了实验基础。