Exendin-4对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的干预效果及作用机制研究

赵延辉解成霞

(青海红十字医院，西宁 810000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)严重的并发症之一，可导致严重肾衰竭。糖尿病肾病一旦出现持续性蛋白尿病情将无法逆转，直至终末期肾衰竭，且糖尿病肾病的患病率逐年增加[1－2]。糖尿病代谢异常会直接导致肾小球硬化，进而导致肾功能损伤，因此临床通过强化血糖控制来降低糖尿病肾病发生的风险。Exendin-4是一种肠降糖素类似物，由39个氨基酸组成的多肽，主要产生于蜥蜴(Gila monster lizard)的唾液腺中，能够减轻体重，改善胰岛细胞功能，呈剂量依赖性促进胰岛素分泌，可发挥治疗糖尿病肾病的作用[2－4]，但Exendin-4对于糖尿病所致肾病的作用研究较少。大量文献报道激活的PDK1/Akt/mTOR通路参与了糖尿病肾病的发病过程，许多用于治疗糖尿病肾病的药物均与调控该通道相关[5－6]。因此在本文拟采用Exendin-4对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠进行干预治疗，为Exendin-4的临床应用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

无特定病原体动物(specific pathngen free animal，SPF)级SD健康雄性大鼠54只，体重(219.7±8.5)g，鼠龄(3.5±0.2)月；均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。在青海大学医学院动物实验室[SYXK(青)2019-0001]中将SD大鼠均养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%~40%，每天光照12 h，自由饮用纯净水，适应性饲养1周后开展实验。本文研究所做实验均获得青海红十字医院伦理委员会批准(E20190015)，并满足动物实验学中的3R要求。

1.2 主要试剂与仪器

ME104E型电子分析天平(美国梅特勒-托利多公司)；SZX12-3111型显微镜(日本奥利巴斯公司)；DOTOP型全自动生化仪(广州东唐电子科技有限公司)；Exendin-4(浙江鸿拓生物技术有限公司)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美国Sigma)；总胆固醇(total cholesterol， TG)、甘油三酯(triglycerides，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL))、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL)、淀粉酶(amylase，AMY)试剂盒(上海抚生实业有限公司)；血糖(blood glucose，BG)试剂盒(上海钰博生物科技有限公司-仪器信息网)；糖化血红蛋白(hemoglobin，HbAlc)和空腹血清胰岛素(fasting serum insulin，FINS)试剂盒均购自南京基蛋生物科技有限公司；兔抗鼠晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs，艾美捷科技有限公司)、兔抗鼠PDK1抗体(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠p-Akt抗体(厦门研科生物技术有限公司)；兔抗鼠p-mTOR抗体(上海安研商贸有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、建模及给药

随机选取60只大鼠中9只作为正常组，其余大鼠参照邵晓丽等[7]方法建立糖尿病肾病模型，对大鼠腹腔一次性注射STZ 60 mg/kg，当BG≥16.7 mmol/L，尿糖为＋＋＋＋以上表明糖尿病肾病大鼠模型建立成功。将糖尿病肾病大鼠随机分为模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组，每组各9只。贝那普利组灌胃10 mg/kg贝那普利片，Exendin-4低、中和高剂量组大鼠分别皮下注射Exendin-4 4、20、100μg/kg，正常组和模型组灌胃给予纯净水，灌胃或注射体积均为20μL/g。所有大鼠均连续给药1周。

1.3.2 TG、TC、HDL、LDL水平检测

给药结束后，给予全麻，抽取腹主静脉血5 mL置于抗凝管，5000 r/min离心10 min，取血浆，使用DOTOP型全自动生化仪检测TG、TC、HDL、LDL水平。

1.3.3 BG、HbAlc和FINS

抽取腹主静脉血5 mL，5000 r/min离心10 min，取血清，采用葡萄糖氧化酶法检测BG；采用酶法检测HbAlc；采用放射免疫法检测FINS。

1.3.4 体重和肾脏指数(renal index，RI)、肾小球面积及肾小球直径

给药前及给药结束称量体重。给药结束，取血结束，安乐处死大鼠，开腹取左肾和右肾，测重量，取左肾，采用10%的中性福尔马林溶液固定，常规制片，光镜下测量左肾和右肾的肾小球的直径和面积，计算RI＝(左肾重量＋右肾重量)/体重×100%。

1.3.5 切片及染色

取“1.3.4”项下切片，脱水透明，浸蜡包埋，脱蜡、HE染色，镜下观察大鼠肾组织病理学表现。

1.3.6 AGEs及PDK1/Akt/mTOR通路蛋白检测

取“1.3.4”项下右肾，使用Western blot检测AGEs、PDK1、p-Akt、p-mTOR通路蛋白，提取肾组织中的样品总蛋白，与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min后，进行电泳，并将蛋白电转至PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉封闭1~2 h，然后加入一抗溶液TBST(AGEs、PDK1、p-Akt、p-mTOR按照1∶1000稀释)，在4℃条件下震荡过夜，再次洗涤，放入二抗，室内震荡120 min后，洗涤，显色成像，使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析处理。计量资料采用平均数±标准差(±s)描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理组织学观察

如图1所示，空白组肾小管结构正常，肾间质未见明显的炎性细胞增生，模型组肾小球上皮细胞变性，肾小管周围明显炎性细胞浸润，肾间质增宽，管腔内可见坏死脱落的上皮细胞，小管空泡变性萎缩；贝那普利组肾间质炎性细胞浸润减少，肾小管上皮细胞肿胀和坏死程度减轻；Exendin-4各组的肾间质炎性细胞减少，管腔内坏死脱落的上皮细胞减少，小管变性萎缩空泡减少，其中Exendin-4中剂量组肾间质偶见炎性细胞，管腔内坏死脱落的上皮细胞明显减少，肾病变改善明显。

图1 六组大鼠肾组织损伤情况HE染色图Figure 1 HE staining of renal tissue injury in six groups of rats

2.2 六组大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比较

如表1所示，模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠血清TG、TC、LDL、AMY水平均高于空白组，HDL均低于空白组，具有显著性差异(P<0.05)；贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于模型组，HDL均高于模型组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4低、中和高剂量组大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于贝那普利组，HDL均高于贝那普利组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4中和高剂量组大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4低剂量组，HDL均高于Exendin-4低剂量组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4高剂量组大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4中剂量组，HDL均高于Exendin-4中剂量组，其中TC、HDL、LDL、AMY、HDL具有显著性差异(P<0.05)。

表1 六组大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比较(±s，n＝9)Table 1 Comparison of TG，TC，HDL，LDL and AMY levels in six groups of rats

表1 六组大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比较(±s，n＝9)Table 1 Comparison of TG，TC，HDL，LDL and AMY levels in six groups of rats

注:与空白组相比，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与贝那普利组相比，3)P<0.05；与Exendin-4低剂量组相比，4)P<0.05；与Exendin-4中剂量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

组别Groups总胆固醇(mmol/L)TG甘油三酯(mmol/L)TC高密度脂蛋白(mmol/L)HDL低密度脂蛋白(mmol/L)LDL淀粉酶(U/L)AMY空白组Blank group 1.35±0.11 0.93±0.06 2.99±0.15 2.19±0.06 1035.26±536.24模型组Model group 19.56±2.561) 3.89±0.151) 1.78±0.121) 4.99±0.151) 5698.35±658.691)贝那普利组Benazepril group 18.11±2.331)2) 3.75±0.131)2) 1.98±0.111)2) 4.71±0.121)2) 3125.26±625.391)2)Exendin-4低剂量组Exendin-4 low dose group 17.21±2.151)2)3) 3.21±0.111)2)3) 2.11±0.091)2)3) 3.86±0.111)2)3) 2435.26±513.241)2)3)Exendin-4中剂量组Exendin-4 medium dose group 13.15±1.561)2)3)4) 2.25±0.061)2)3)4) 2.55±0.111)2)3)4) 3.11±0.081)2)3)4) 1835.14±489.361)2)3)4 Exendin-4高剂量组Exendin-4 high dose group 12.89±1.461)2)3)4) 2.01±0.081)2)3)4)5) 2.89±0.111)2)3)4)5) 2.98±0.071)2)3)4)5) 1335.24±399.861)2)3)4 F 31.980 82.449 166.574 77.992 88.409 P 0.001 0.001 0.000 0.001 0.000))5)

2.3 六组大鼠BG、HbAlc、FINS水平比较

如表2所示，模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS水平均高于空白组，具有显著性差异(P<0.05)；贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于模型组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4低、中和高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于贝那普利组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4中和高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于Exendin-4低剂量组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于Exendin-4中剂量组，但无显著性差异(P>0.05)。

表2 六组大鼠BG、HbAlc、FINS水平比较(±s，n＝9)Table 2 Comparison of BG，HbAlc and FINSlevels in six groups of rats

表2 六组大鼠BG、HbAlc、FINS水平比较(±s，n＝9)Table 2 Comparison of BG，HbAlc and FINSlevels in six groups of rats

注:与空白组相比，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与贝那普利组相比，3)P<0.05；与Exendin-4低剂量组相比，4)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.

组别Groups血糖(mmol/L)BG糖化血红蛋白(%)HbAlc空腹血清胰岛(μU/mL)FINS空白组Blank group 8.62±1.26 28.46±3.11 15.26±2.13模型组Model group 29.88±1.891) 37.89±3.261) 33.69±6.881)贝那普利组Benazepril group 21.56±3.111)2) 33.15±3.151)2) 29.88±4.151)2)Exendin-4低剂量组Exendin-4 low dose group 19.88±2.151)2)3) 30.11±2.101)2)3) 26.15±3.121)2)3)Exendin-4中剂量组Exendin-4 medium dose group 12.56±1.151)2)3)4) 29.88±2.561)2)3)4) 19.51±2.131)2)3)4)Exendin-4高剂量组Exendin-4 high dose group 12.11±1.211)2)3)4) 29.16±2.111)2)3)4) 19.01±1.891)2)3)4)F 42.118 9.418 11.515 P 0.001 0.001 0.001

2.4 六组大鼠体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径比较

如表3和表4所示，模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径均高于空白组，具有显著性差异(P<0.05)；贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径低于模型组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4低、中和高剂量组大鼠体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径低于贝那普利组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4中、高剂量组大鼠体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径低于Exendin-4低剂量组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4高剂量组大鼠体重、RI、AGEs、肾小球面积、肾小球直径低于Exendin-4中剂量组，其中体重、RI、肾小球面积具有显著性差异(P<0.05)。

表3 六组大鼠体重、RI比较(±s，n＝9)Table 3 Comparison of weight，RI in six groups of rats

表3 六组大鼠体重、RI比较(±s，n＝9)Table 3 Comparison of weight，RI in six groups of rats

注:与空白组相比，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与贝那普利组相比，3)P<0.05；与Exendin-4低剂量组相比，4)P<0.05；与Exendin-4中剂量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

组别Groups给药前体重(g)Quality before administration给药结束体重(g)End body mass肾脏指数RI空白组Blank group 219.12±8.65 244.36±8.67 0.21±0.02模型组Model group 221.52±9.02 296.95±8.341) 0.59±0.111)贝那普利组Benazepril group 215.96±7.98 265.69±8.291)2) 0.42±0.091)2)Exendin-4低剂量组Exendin-4 low dose group 221.09±7.46 284.36±7.361)2)3) 0.38±0.021)2)3)Exendin-4中剂量组Exendin-4 medium dose group 221.09±7.36 276.34±8.151)2)3)4) 0.25±0.031)2)3)4)Exendin-4高剂量组Exendin-4 high dose group 219.46±7.15 263.25±8.161)2)3)4)5) 0.24±0.021)2)3)4)5)F 0.611 45.135 15.295 P 0.692 0.000 0.001

表4 六组大鼠AGEs、肾小球面积、肾小球直径比较(±s，n＝9)Table 4 Comparison of AGEs，glomerular area and glomerular diameter among the six groups

表4 六组大鼠AGEs、肾小球面积、肾小球直径比较(±s，n＝9)Table 4 Comparison of AGEs，glomerular area and glomerular diameter among the six groups

注:与空白组相比，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与贝那普利组相比，3)P<0.05；与Exendin-4低剂量组相比，4)P<0.05；与Exendin-4中剂量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

组别Groups晚期糖基化终末产物AGEs肾小球面积(unit)Glomerular area肾小球直径(μm)Renal didiameter空白组Blank group 0.68±0.21 74.15±9.89 91.26±5.46模型组Model group 1.87±0.481) 119.45±12.221) 121.56±11.221)贝那普利组Benazepril group 1.05±0.351)2) 101.01±10.211)2) 114.33±10.251)2)Exendin-4低剂量组Exendin-4 low dose group 1.38±0.471)2)3) 98.02±9.881)2)3) 110.12±9.891)2)3)Exendin-4中剂量组Exendin-4 medium dose group 0.95±0.411)2)3)4) 81.25±7.891)2)3)4) 95.21±8.111)2)3)4)Exendin-4高剂量组Exendin-4 high dose group 0.59±0.281)2)3)4) 79.88±7.451)2)3)4)5) 94.11±8.261)2)3)4)F 14.140 12.967 10.927 P 0.000 0.001 0.001

2.5 六组大鼠肾组织PDK1/Akt/mTOR信号通路蛋白表达量比较

如表5、图2所示，模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量均高于空白组，具有显著性差异(P<0.05)；贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量低于模型组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4低、中和高剂量组大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量低于贝那普利组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4中和高剂量组大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量低于Exendin-4低剂量组，具有显著性差异(P<0.05)；Exendin-4高剂量组大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量低于Exendin-4中剂量组，但差异无显著性差异(P>0.05)。

图2 肾组织中PDK1/Akt/mTOR通路蛋白PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白Western blot图Figure 2 Western blot of PDK1/Akt/mTOR pathway protein PDK1，p-Akt，p-mTOR protein in renal tissue

表5 六组大鼠肾组织PDK1/Akt/mTOR信号通路蛋白表达量比较(±s，n＝9)Table 5 Comparison of PDK1/Akt/mTOR signal pathway protein expression in six groups of rats

表5 六组大鼠肾组织PDK1/Akt/mTOR信号通路蛋白表达量比较(±s，n＝9)Table 5 Comparison of PDK1/Akt/mTOR signal pathway protein expression in six groups of rats

注:与空白组相比，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与贝那普利组相比，3)P<0.05；与Exendin-4低剂量组相比，4)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.

组别Groups磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 PDK1磷酸化Akt p-Akt磷酸化mTOR p-mTOR空白组Blank group 1.01±0.03 0.98±0.03 1.05±0.02模型组Model group 2.89±0.021) 2.56±0.111) 2.45±0.101)贝那普利组Benazepril group 2.45±0.031)2) 2.31±0.031)2) 2.22±0.111)2)Exendin-4低剂量组Exendin-4 low dose group 2.01±0.011)2)3) 1.56±0.011)2)3) 1.58±0.061)2)3)Exendin-4中剂量组Exendin-4 medium dose group 1.25±0.021)2)3)4) 1.12±0.051)2)3)4) 1.22±0.011)2)3)4)Exendin-4高剂量组Exendin-4 high dose group 1.24±0.011)2)3)4) 1.11±0.011)2)3)4) 1.21±0.031)2)3)4)F 234.638 62.359 61.777 P 0.001 0.001 0.001

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者进行肾移植常见原因，其病理特点为肾小球大量堆积、肾小管底膜增厚，导致肾小球硬化、肾小管纤维化，直至肾功能衰竭[8－10]。

Exendin-4能够通过抑制胰高血糖素的分泌，延缓胃排空和食物的摄取量，进而减轻体重，本研究显示，与糖尿病肾病模型组相比，给予不同剂量的Exendin-4可明显减轻糖尿病肾病大鼠的体重，且呈Exendin-4剂量依赖性减低趋势，进一步佐证Exendin-4可减轻体重。研究表明，Exendin-4可抑制TNF-α诱导的系膜细胞氧化应激和TGF-β1表达[11]，另外，Exendin-4能够激活PPAR-α受体，减少载脂蛋白的合成，进而增加血浆中的脂肪降解和清除力度来调节脂代谢紊乱[12－13]。Exendin-4能够通过增加胰岛β细胞对葡萄糖的敏感性，促进血糖胰岛素的分泌，改善糖代谢及脂代谢紊乱[14－15]。本研究显示，Exendin-4中、高剂量组大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4低剂量组，且Exendin-4高剂量组大鼠TG、TC、LDL水平均低于Exendin-4中剂量组，HDL的变化趋势相反，该结果表明，Exendin-4可有效降低糖尿病肾病大鼠血液的TG、TC、LDL、AMY水平，提高HDL，且呈Exendin-4剂量依赖性趋势，可见Exendin-4在改善脂代谢紊乱具有明确的效果。研究表明，Exendin-4可明显抑制TNF-α诱导的系膜细胞MCP-1 mRNA的表达，并以剂量和时间依赖的方式抑制TNF-α诱导的系膜细胞培养上清内MCP-1、FN的含量，提示Exendin-4可能会对肾具有一定保护作用[16]。本研究显示Exendin-4可显著降低糖尿病肾病大鼠RI、肾小球面积、肾小球直径，提示Exendin-4可改善肾功能。HbAlc能够衡量血糖控制情况的重要指标，其可作为临床评定糖尿病病情及治疗预后的重要诊断依据[17]。本研究显示，Exendin-4中、高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS、AGEs水平均低于Exendin-4低剂量组，且Exendin-4高剂量组大鼠BG、HbAlc、FINS、AGEs水平均低于Exendin-4中剂量组，该结果表明，Exendin-4能够有效改善各组大鼠的血糖水平，可用于改善糖尿病肾病的糖代谢紊乱。

PDK1作为PI3K信号通路的重要传导分子，是AGC蛋白激酶家族的一个苏氨酸激酶，其与PIP3的结合能够激活Akt等激酶，并且能够通过调节AGC蛋白控制细胞的应答，在细胞的生长增殖和存活中发挥着重要作用[18－19]。p-mTOR属于PIKK家族中的一员，其对调节细胞周期、蛋白质的合成发挥着重要的作用，在糖尿病发生时，高血糖能够激活Akt而增加mTOR的活性，mTOR活性增加会促进肾小球和肾小管肥大[20－21]。本研究显示，不同剂量Exendin-4干预大鼠，大鼠的PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达呈现与Exendin-4剂量负相关的趋势，可见Exendin-4可在一定程度上通过调节PDK1、p-Akt、p-mTOR表达达到治疗糖尿病肾病的目的。类似的报道，如Vasu等[22]认为Exendin-4作为多肽，可通过调节PDK1蛋白表达来降低高脂饮食诱导的β细胞增殖和凋亡。Zhang等[23]通过免疫印迹方法显示，给衰老的成骨细胞Exendin-4干预，Exendin-4通过调节p-Akt表达，促进衰老成骨细胞的增殖，进而可用于预防老年性骨质疏松症。Yu等[24]研究认为Exendin-4可通过调节mTOR表达来缓和葡萄糖对心肌细胞的毒性作用。

综上所述，Exendin-4能够减轻STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的炎症水平，改善其血糖、血脂水平，其作用机制可能与PDK1/Akt/mTOR通路受到抑制有关，为临床上治疗糖尿病肾病等其他炎症病症提供了新的方向。