2015—2019 年辽宁省麻疹病毒基因型及流行株血凝素基因特征分析

郝爽，王文思，方兴，王艳

辽宁省疾病预防控制中心免疫规划所，辽宁沈阳110005

麻疹病毒（measles virus，MEV）是副黏病毒科，麻疹病毒属成员，为单股负链RNA 病毒。病毒基因组有6 个结构基因，编码6 个主要结构蛋白，分别为核蛋白（nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白（phosphoprotein，P）、膜蛋白（matrix ，M）、血溶素蛋白（fusion，F）、血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）蛋白和依赖于RNA的 RNA 聚合酶（large protein，L）。其中 H 蛋白能参与病毒感染，与宿主细胞受体吸附［1-2］。病毒感染后产生抗H 抗体，具有中和病毒的作用，因此，H 蛋白是研究麻疹病毒特征的重要蛋白。

麻疹病毒有24 个基因型，但仅有1 个血清型，因此，有效的疫苗接种有望实现消除计划［3-4］，2014年之前，辽宁省监测到的麻疹病毒均为H1a 基因型，本文对2014 年经历麻疹大流行后，2015 — 2019 年辽宁省流行的麻疹病毒基因型及流行株H 基因特征进行分析，探讨其是否发生变化，以期为实现消除麻疹目标提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 麻疹病毒序列来源 本研究中共获取53 条麻疹病毒序列，其中30 条来自2015 — 2019 年分离的麻疹病毒，23 条来自麻疹疑似病例的原始咽拭子或尿液标本。标本的采集处理和病毒分离方法按照《麻疹诊断标准》WS 296-2008、《麻疹诊断》WS 296-2017 的要求进行。

1.2 主要试剂及仪器 Rneasy mini kit 和One-step RTPCR ki（t100，货号：210212）购自德国QIAGEN 公司。

1.3 麻疹病毒RNA 提取及RT-PCR 采用Rneasy mini kit 提取麻疹病毒RNA，用One-step RT-PCR kit 扩增病毒N 基因羧基末端450 bp 核苷酸和H 基因全长1854bp 核苷酸，RT-PCR 引物及反应条件参照文献［5］。

1.4 序列测定及结果分析 扩增后的PCR 产物送至北京赛默飞测序有限公司进行纯化及序列测定。利用MEGA 5.0 和Sequencher-4.0.5 软件对N 基因（450 bp）和 H 基因（1 854 bp）测序结果进行拼接和处理分析，调出GenBank 中WHO 推荐的麻疹病毒N 和H 参考株进行核苷酸和氨基酸比对分析（pdistance 模型），并构建进化树（邻位-连接法，bootstrap检验，抽样次数 500，Kimura-2 Parameter 模型）。

2 结 果

2.1 2015—2019 年辽宁省流行的麻疹病毒基因型别 将2015 — 2019 年获得的53 个麻疹病毒序列N 基因末端450 bp 核苷酸与WHO 参考株进行基因序列比对，构建的基因亲缘性关系树见图1，47 株病毒为 H1a 基因型，1 株为 D8 基因型（2018 年），该株D8基因型为我省首次检测到，5 株为A 基因型（全部为临床标本）。

图1 2015 — 2019 年辽宁省麻疹病毒与WHO 参考株基于N 基因（450 bp）构建的基因亲缘性关系树Fig.1 Phylogenetic tree of measles virus and WHO refe-rence strain based on N gene（450 bp）in Liaoning Province from 2015 to 2019

2.2 2015—2019 年辽宁省麻疹病毒H1a 基因型流行株H 基因特征分析 2015 — 2019 年共分离出毒株30 株，应用RT-PCR 对30 株毒株的H 基因全长1 854 个核苷酸进行扩增，并与WHO 参考株进行比对分析，29 株为 H1a 基因型，1 株（Liaoning2018-03）为D8 基因型（2019 年未分离到麻疹毒株），见图2。

2.3 核苷酸与氨基酸变异分析 29 株H1a 基因型麻疹病毒H 基因核苷酸序列同源性为98.0% ～100%，氨基酸序列同源性为97.5% ～100%，与我国H1a 参考株China93-4 核苷酸序列同源性为98.6%～99%，氨基酸序列同源性为98.3% ～99%；与我国目前使用的疫苗株Shanghai-191 核苷酸序列同源性为94.4%～95.3%，氨基酸序列同源性为90.3%～90.8%。我省首次分离到的D8 基因型麻疹病毒与我国疫苗株Shanghai-191 核苷酸序列同源性为96.4%，氨基酸序列同源性为97.1%。

2.4 遗传距离 2015—2019 年分离到的29 株H1a基因型麻疹病毒分为两个簇：Cluster1 和Cluster2，Cluster1 和Cluster2 之间核苷酸和氨基酸平均遗传距离分别为0.018 和0.021。Cluster1 和Cluster2与疫苗株Shanghai-191 核苷酸和氨基酸平均遗传距离分别为 0.054 和 0.093，0.056 和 0.093。见图2。

图2 2015 — 2019 年辽宁省麻疹病毒与WHO 参考株基于H 基因（1 854 bp）构建的基因亲缘性关系树Fig.2 Phylogenetic tree of wild strain measles and WHO reference strain based on H gene（1 854 bp）in Liaoning Province from 2015 to 2019

2015 — 2019 年分离的H1a 基因型麻疹病毒核苷酸及氨基酸变异最大的是2018 年，且随年份增加，遗传距离有逐渐增大趋势，见表1。

表1 2015 — 2019 年H1a 基因型麻疹病毒分离株与疫苗株H 基因组间平均遗传距离比较Tab.1 Comparison of mean genetic distance of H genomes of isolates and vaccine strain of measles virus of genotype H1a from 2015 to 2019

2.5 2015—2019 年辽宁省H1a 基因型麻疹病毒流行株H 基因重要位点变异分析 辽宁省2015 —2019 年H1a 基因型麻疹毒株中H 蛋白保留了与疫苗株Shanghai-191 相同的4 个糖基化位点，这4 个位点分别位于 168-170（N-S-T）、187-189（N-C-S）、200-202（N-M-S）、215-217（N-V-S），但在第 5 个糖基化位点上238-240（N-L-S）的240 位氨基酸均由丝氨酸（SerS）突变成为天冬酰胺酸（AsnN），从而造成该糖基化位点的缺失。

辽宁省分离到的29 株H1a 基因型麻疹病毒分为两个簇：Cluster1（28 株）和 Cluster2（1 株），Cluster1 所有毒株均在第397 位发生了氨基酸的替换，由脯氨酸（Pro P）突变成亮氨酸（Leu L），而 Cluster2 并未发生该改变。这29 株H1a 基因型毒株与

疫苗株Shanghai-191 相比，共同稳定变异的有26 个氨基酸位点：18、133、149、211、240、243、276、280、282、303、334、359、364、397、405、420、421、423、476、481、484、562、576，603、613、614aa。

3 讨 论

麻疹是一种传染性很强的急性呼吸道传染病［6-8］，本文分析了辽宁省2015 — 2019 年麻疹病毒基因型及流行株H 基因特征，结果显示，我省48 份麻疹病毒与我国麻疹参考株China9322 ／ H1a 为同一基因型，bootstrap 值为97%，其中29 份H1a 基因型分离得到毒株，将这些野毒株与WHO 参考株基于H基因1 854 bp 进行对比，有些毒株显示同一年份由相同病毒传播链引起，核苷酸序列同源性为100%，如Liaoning2015-07 和Liaoning2015-09。有些毒株显示在关系树上分布在同一个分支但不同年份，核苷酸序列同源性为100%，如LiaoningCZ-07-216-2016和LiaoningCZ-07-198-2015，表明辽宁省有相同的麻疹病毒在不同年份同时流行。

辽宁省2015 — 2019 年H1a 基因型毒株与疫苗株Shanghai-191 核苷酸及氨基酸遗传距离分别为0.056-0.059、0.093-0.095，与辽宁省 1997 — 2014年麻疹H1a 基因型和Shanghai-191 基因型核苷酸氨基酸遗传距离 0.049-0.055、0.042-0.051［9］有所增加，提示辽宁省H1a 基因型麻疹毒株H 基因自1997年起变异正在逐年累计，对当前Shanghai-191 疫苗免疫效果可能会有影响。

通过分析，H1a 基因型麻疹毒株H 基因氨基末端 4 个潜在的糖基化位点（168-170、187-189、200-202、215-217）均保持稳定，第5 个糖基化位点238-240 上丝氨酸（SerS）突变成天冬酰胺酸（AsnN）导致该个糖基化位点消失，但该糖基化位点相比其他位点对抗原结构及折叠的作用较小，因此，推测该糖基化位点的消失对蛋白的功能不会产生较大影响［10］。

辽宁省2015 — 2019 年以来流行的H1a 基因型麻疹毒株在系统进化树上分成2 个独立分支：Cluster 1 和 Cluster 2，研究发现，Cluster1 在 397 位点由脯氨酸（Pro P）突变成亮氨酸（Leu L），但 Cluster 2并未发生变化，其中Cluster 1 病毒循环数量在辽宁省更多，第379 ～410 位是麻疹病毒H 线性抗原决定簇，该氨基酸变异结果将会影响单克隆抗体与之结合，该结果与辽宁省1997 ～2014 年麻疹毒株研究一致，这也可能是Cluster1 与Shanghai-191 疫苗株相比，核苷酸遗传距离比Cluster2 大的原因，辽宁省H1a 基因型毒株与疫苗株Shanghai-191 相比，发生稳定变异的有26 个位点，303 和211 位点为抗原决定簇 位 点 ，240、243、280、282、303、359、364、397、405、420、481、484、562、576 这几个位点位于蛋白外模表面，它们的变异可能会导致抗体中和效率的下降，影响免疫效率以及持久性［11-13］。

辽宁省自1997 年开展麻疹病毒监测以来，分离到的麻疹病毒仍以H1a 基因型为主，近年来又陆续检测到A 基因型疫苗株病毒以及首次在2018 年分离到D8 基因型病毒［14］，我省麻疹监测网络敏感性正逐渐提升。H1a 基因型病毒与疫苗株相比，在H蛋白个别氨基酸功能位点上发生了变异，但在进化上并未发生重要氨基酸功能位点的显著变异，辽宁省H1a 基因型麻疹病毒在绝大部分功能位点上保持稳定，我国使用的麻疹疫苗对目前流行的麻疹病毒株仍具有较好的保护效果［15］。