梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

周亮第，姚正培，杨文艳，刘 豪，张振清，王 波，任燕萍，张 桦

(新疆农业大学 农学院,乌鲁木齐 830052)

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)是藜科(Chenopodiaceae)梭梭属(Haloxylon)超旱生植物，它生长在荒漠和半荒漠地区，具有较强的抗旱、耐极端温度、耐盐碱、耐贫瘠等生态适应性[1]，被称为“沙漠卫士”，在防风固沙、保护生态环境、改善小气候方面具有不可替代的作用[2]。干旱一般被认为是影响梭梭幼苗成活的主要因素，而在荒漠极端环境条件下，导致梭梭自然更新困难的主要因素还有地表高温对其幼苗和幼株存活的影响。Yu等[3]通过模拟地表高温胁迫试验发现地表高温是影响梭梭幼苗存活的主要原因之一。深入探究梭梭抗逆分子机制、挖掘相关抗逆基因对于充分发掘梭梭植物资源潜力及提高梭梭种植中的幼苗存活率具有重要意义。NAC转录因子是陆生植物特有的、成员最多的转录因子家族之一，其名称由均含有NAC结构域的矮牵牛NAM、拟南芥ATAF1/2及CUC基因首字母缩合而成[4]。典型的NAC蛋白N端是一个高度保守的可结合DNA的NAC结构域，包含大约150个氨基酸残基，构成A～E5个亚结构域，C端是一个高度可变的转录调节区[5]。近年来，随着基因组测序技术的发展，拟南芥(Arabidopsisthaliana)[6-7]、水稻(Oryzasativa)[8-10]、葡萄(Vitisvinifera)[11]、烟草(Nicotianatabacum)[12]、玉米(Zeamays)[13]，马铃薯(Solanumtuberosum)[14]，紫花苜蓿(Medicagotruncatula)[15]，大豆(Glycinemax)[16-17]等多种植物的NAC家族成员得以鉴定。对NAC基因的表达特性及生物学功能研究表明，NAC转录因子在植物侧根发生[18]、细胞次生壁积累[19]、木质部导管形成[20]、细胞分化控制[21]等生长发育过程中通过调节下游功能基因而行使重要作用。同时，NAC转录因子也广泛参与植物响应生物和非生物逆境胁迫，已被证实NAC转录因子能够响应干旱、高盐、低温、高温、ABA等非生物胁迫，过表达NAC基因的转基因植株抗逆性得到提高[5-18,22-23]。转录组生物信息学分析结果显示，NAC基因家族中有约20%～25%的成员至少能响应一种胁迫[10，24-25]。由此可见，NAC转录因子在植物响应逆境胁迫、提高抗逆性中发挥重要作用。开展梭梭NAC基因相关研究对于深入理解梭梭抗逆机制具有重要指导意义。

本研究以梭梭为材料，克隆HaNAC20基因，并对其生物信息学特征、逆境响应特性、亚细胞定位和转录激活活性及转录激活功能域进行分析，为深入探索梭梭抗逆机制提供依据，为抗逆基因工程提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)种子采集于新疆阜康沙漠植物园，室温自然干燥后保存于-20 ℃冰箱，备用。

1.2 HaNAC20克隆与生物信息学分析

根据实验室前期梭梭干旱和模拟地表高温胁迫转录组测序结果，对含有NAC结构域的序列进行差异表达分析，筛选阈值为Qvalue<0.005且|log2FoldChange|>1，选择在转录组数据中响应胁迫上调表达的NAC基因Unigene序列开展本研究。以HaNAC20Unigene序列为模板，使用Primer 5.0软件设计克隆引物(F：5′-CTTCAACCTTCGTCAATCGT-3′，R：5′-ATCTGACAGGCATTGGGCAT-3′)。提取干旱胁迫后的梭梭总RNA，以反转录产物cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系包括10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、上下游引物各2.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、超纯水15 μL，总体积为25 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。琼脂糖凝胶(10 g/L)电泳后，用胶回收试剂盒法(全式金公司)回收PCR产物目的条带，连接pEASY-T1 simple载体(全式金公司)，进行 测序。

对HaNAC20基因编码的蛋白进行生物信息学分析。使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)进行理化性质分析，使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行相似序列搜索，使用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)进行功能结构域预测，使用cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)预测核定位信号，使用DNAMAN软件分析测序结果、识别开放阅读框序列(ORF)、输出多序列比对结果，使用MEGA 5软件以NJ法构建系统发育树分析所属基因亚族。

1.3 HaNAC20基因不同胁迫处理下的表达量

参照刘豪[26]、宗兴风等[27]的方法，培养梭梭幼苗，待幼苗根系充分生长、同化枝长度约10 cm时进行试验处理。分别使用20% PEG6000溶液、200 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/L IAA溶液和100 μmol/L ABA溶液处理梭梭幼苗，于处理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h时采集梭梭同化枝作为分析基因表达量材料，液氮速冻后置于 -80 ℃冰箱保存。选取沙土中生长一致的1 a龄梭梭苗进行模拟地表高温胁迫：用电热带控温(专利号：201010283141.0)加热地表土壤模拟地表高温胁迫，分别在55 ℃高温胁迫0 h、2 h、 12 h、24 h时采集根和同化枝样品，胁迫24 h后降温维持在 30 ℃恢复，并在胁迫后3 d、6 d和 15 d时继续采集根和同化枝样品，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 GFP融合表达载体构建和亚细胞定位分析

根据HaNAC20CDS序列设计引物(F：5′-CCCAGATCTGATGGATGCAAAAAGATGT-TCTAG-3′，R：5′-CGACTAGTAAACTGCTTGTAAGATATGTGTTCC-3′)，使用无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞公司)将HaNAC20全长CDS(不含终止密码子)连接到pCAMBIA1304载体上，构建35S::HaNAC20-GFP融合载体并转化根癌农杆菌GV3101。使用农杆菌介导法瞬时转化洋葱表皮细胞[29]，在激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 510 SYSTEM)下观察GFP融合蛋白绿色荧光分布情况。

1.5 酵母单杂交分析转录激活活性及转录激活功能域

为分析该转录因子的转录激活活性及转录激活功能域，设计HaNAC20基因全长编码区引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGATGGATGCAAAAAGATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCTTACTAAAACTGCTTGTAAGATATGTTCCCA-3′)、N端结构域编码区引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGGATGCAAAAA-GATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCCTTCTTGTAAATTCGACATAAT-ACCC-3′)及C端结构域编码区引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGAGGCATGTAG-CAAGGACAGA-3′，R：5′-TCGACGGATCCC-CGGGAATTCCTAAAACTGCTTGTAAGAT-ATGTTCC-3′)。使用无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞)分别将HaNAC20全长、N端、C端的编码区序列插入到酵母表达载体pGBKT7中，重组转化子分别命名为pGBKT7-F、pGBKT7-N、pGBKT7-C，并转化酵母AH109感受态细胞涂布于全营养型和SD/-Trp一缺培养基上观察生长情况，再于SD/-Trp/-His/-Ade三缺培养基中，用X-Gal染色分析转录自激活活性及转录激活功能域。

2 结果与分析

2.1 梭梭 HaNAC20基因克隆

以梭梭cDNA为模板，扩增得到985 bp的片段(图1)。目的片段经回收、连接、转化、测序、ORF识别及编码蛋白翻译，结果显示该序列中包含长度为822 bp(GenBank登录号：KU845314)的ORF序列，编码273个氨基酸的蛋白序列。

2.2 HaNAC20基因的生物信息学分析

对梭梭HaNAC20基因编码的273个氨基酸的蛋白进行生物信息学分析。ProtParam预测分析表明，该蛋白分子质量31.12 ku，含29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)，含33个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)，理论等电点8.73，总平均疏水性为-0.703，是一个亲水蛋白。经BLAST序列搜索，梭梭HaNAC20基因编码的蛋白与菠菜NAC蛋白(KNA22936)相似性为87.7%，与藜麦NAC蛋白(XP_021747028)的相似性为84.4%，与甜菜NAC蛋白(KMT07023)的相似性为 82.2%，与拟南芥NAC蛋白(AAM63330)的相似性是61%。多序列比对结果及功能结构域预测分析表明， HaNAC20蛋白N端有一个保守的NAC家族特有的结构域(分A、B、C、D、E 5个区)，而一致性低的C端是转录激活区(图2-A，图2-B)，135～167 aa处具有一个核定位信号区(图2-C)，证明HaNAC20具有NAC转录因子的典型特征，是梭梭NAC转录因子家族成员。进而选取拟南芥、水稻和鹰嘴豆的NAC蛋白序列构建系统发生树，结果显示HaNAC20属于NAC家族SNAC亚族(图2-D)。

2.3 不同处理下梭梭 HaNAC20基因的表达 分析

采用实时荧光定量PCR分析HaNAC20基因对非生物逆境及激素处理的响应特性，结果显示，干旱、高盐、高温、IAA、ABA处理均能不同程度诱导该基因上调表达。干旱胁迫后，HaNAC20基因在12 h时表达量显著提高至未胁迫的23倍(图3-A)。高盐处理时，HaNAC20基因在24 h时表达量明显上升至未胁迫的14倍(图3-B)。模拟地表高温胁迫时，同化枝中HaNAC20在55 ℃胁迫处理后3 d达到最大，后表达量下降(图3-C)。而梭梭的根部在55 ℃处理后，HaNAC20在2 h表达量即达到最大，后表达量下降，15 d时恢复到胁迫前水平(图3-D)，表明在地表高温胁迫初期，该基因主要在根中响应，而到胁迫后期在同化枝中响应。HaNAC20基因在IAA处理时表达量呈先上升后下降趋势，在 6 h达到最大，为未胁迫的70倍(图3-E)；在ABA处理时表达量呈逐渐上升趋势(图3-F)。

2.4 HaNAC20蛋白的亚细胞定位分析

在线工具cNLS Mapper预测显示 HaNAC20蛋白具有核定位信号，进一步采用农杆菌侵染法瞬时转化洋葱上表皮细胞分析亚细胞定位。结果表明，HaNAC20与GFP的融合蛋白定位于细胞核中，而空载体的GFP蛋白分布于整个细胞(图4)，证明 HaNAC20蛋白在细胞核内行使其功能。

2.5 HaNAC20蛋白转录激活活性及转录激活功能域的鉴定

酵母单杂交试验结果表明，在YPDA全营养型培养基及SD/-Trp一缺培养基上，含重组载体及空载体的酵母转化子均能快速生长(图5-B)；在SD/-Trp/-His/-Ade三缺培养基上，只有含HaNAC20完整蛋白的pGBKT7-F或含C端的pGBKT7-C重组载体的酵母转化子能够生长(图5-C)，并在X-Gal显色反应中呈现蓝色，表明这两种重组载体中的His和LacZ报告基因被激活表达。这些结果证明 HaNAC20蛋白是一个转录激活功能域位于蛋白C端的转录因子。

3 讨 论

NAC转录因子是陆生植物特有的、成员最多的转录因子家族之一，其成员在拟南芥、水稻和其他植物中参与许多调控和发育过程[30]。本研究从梭梭中克隆得到HaNAC20基因，生物信息学预测及亚细胞定位试验均表明 HaNAC20蛋白定位于细胞核中，这与其他已经验证过的NAC转录因子的亚细胞定位结果一致[31-33]。在过去的研究中，许多NAC家族SNAC亚族成员被鉴定为植物应激反应中参与复杂信号传导过程的重要组成部分，在提高植物应对干旱、高盐、极端温度等非生物逆境方面发挥重要作用[22]。本研究中HaNAC20经系统发育分析表明其属于SNAC亚族，显示其可能参与梭梭响应非生物逆境过程。已有研究表明NAC转录因子家族中部分成员不具有转录激活活性[34]，通常具有转录激活活性的NAC蛋白转录激活功能域位于C端[35]。本研究通过酵母单杂交试验证实HaNAC20具有转录激活功能，并且转录激活结构域位于C端，表明其具有一般转录因子的转录调控功能，这与SNAC亚族基因调控下游逆境耐受功能基因或ABA信号通路基因功能相一致。各种逆境胁迫响应基因功能不同，其表达模式存在差异，已有研究显示NAC基因可响应多种逆境胁迫及激素处理，在处理后多呈上调表达，但不同成员响应模式不尽相同[22，25，27]。本研究中HaNAC20在干旱、高盐、地表高温、IAA和ABA多种逆境胁迫诱导后的不同时间上调表达，在干旱、高盐胁迫12 h后表达量显著上升，而在ABA或IAA激素处理1～3 h后表达量即显著提高，表明HaNAC20对激素处理更加灵敏，其在梭梭应对非生物逆境时可能作为后程调节基因发挥作用。在模拟地表高温胁迫试验中，HaNAC20在梭梭根与同化枝中表达模式明显不同，同化枝中表达量直到24 h后才显著升高，这与黑麦草NAC基因响应高温胁迫模式基本一致[25]；然而，HaNAC20在根中响应非常迅速，2 h即大量表达，随后逐渐下降，15 d时基本恢复正常水平，而同化枝中15 d时仍显著上调表达，推测一方面是因为梭梭生长环境的沙土能快速将地表高温传导至根部诱导基因表达，另一方面，这种地上地下组织基因表达模式的时空差异对梭梭适应沙漠高温环境具有重要意义。与梭梭中HaNAC2相比[27]，HaNAC20在响应高盐时，响应速度及上调倍数均低于HaNAC2，但在响应高温时，持续上调的时间更长，表明梭梭的这两个基因功能上存在侧重，推测HaNAC20在梭梭应对高温胁迫时发挥重要作用。

迄今为止，对NAC转录因子的研究虽然已经取得了一定进展，但仍存在薄弱之处：虽然NAC蛋白的功能多样化，但目前对NAC转录因子应对逆境的研究主要集中在参与响应干旱、高盐、低温等胁迫，关于NAC转录因子在植物应对高温胁迫中的作用研究相对较少；梭梭因其优异的抗逆性，既是典型的野生荒漠植物，也是防风固沙的首选立地植物，其NAC转录因子少有报道，本研究结果可从NAC转录因子这个侧面为揭示梭梭抗逆的分子机制提供依据，为筛选梭梭抗逆材料提供理论指导，也可为植物抗逆基因工程研究提供新的候选基因。

A.重组载体结构图；B.YPDA全营养型培养基中生长状况；C.酵母转化子中 HaNAC20蛋白转录活性分析