山莨菪碱缓解幼龄鼠缺氧缺血性脑组织形态和功能损伤

朱渝， 魏静， 吴鹏程， 袁潇， 周振华， 李敏

1.重庆市第七人民医院神经内科，重庆 400054； 2.重庆医科大学附属永川医院神经内科，重庆 402160；3.陆军军医大学新桥医院神经内科，重庆 400038

缺氧缺血性脑病于新生儿较多发，临床表现主要有兴奋或迟钝，严重时会发生肌张力松软甚至昏迷，该病常伴随学习困难、癫痫、脑瘫等后遗症，严重影响人类生命健康和生活质量[1～3]。研究表明，缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）发病机制主要有脑血流改变、脑血管自主调节功能障碍和脑组织代谢改变等[4]。目前，临床治疗以营养脑细胞药物配合康复训练为主，但治疗效果不确切，因此，探寻新的治疗药物至关重要[5]。山茛菪碱是从茄科植物唐古特山茛菪中分离得出的生物碱，具有外周抗胆碱、改善微循环、抑制血小板聚集、血栓形成、脑梗死、瘫痪、脑血管痉挛、血管神经性头痛、闭塞性血栓性脉管炎等药理作用[6～8]，但山茛菪碱在缺氧缺血性脑损伤中的研究鲜见报道。本实验旨在通过建立缺氧缺血性脑损伤幼鼠模型，探究山茛菪碱在幼鼠脑组织形态损伤和神经元功能损伤中的调节作用，为其在缺氧缺血性脑病中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠50只，雌雄各半，1～2周龄，体质量12～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2016-0008，使用许可证号SYXK（京）2017-0033。

1.1.2 药物、试剂及仪器 山茛菪碱（纯度≥98%）购自成都钠钶锂生物公司（CAS17659-49-3），HE染色试剂盒、TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，SOD、MDA、GSH-Px和BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，TRIzol和RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，HRP标记的二抗、cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔来源的单克隆抗体购 自 美 国 Abcam 公 司（ab184787、ab191468、ab182734、ab117115、ab226843、ab256584）。ABI 7500 Real-Time PCR系统购自美国Applied Biosystems公司，脱 色 摇 床（Servicebio，TSY-B），掌 上 离 心 机（Servicebio，MX-F），组织摊片机（浙江金华市科迪仪器设备有限公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，RM2016），酶 标 仪（Rayto，RT-6100），移 液 枪（Dragon，KE0003087／KA0056573），台式高速离心机（DRAGONLAB，D3024R），光学显微镜（日本尼康，Eclipse E100）。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组、建模及取材 将50只幼龄鼠随机分为健康对照组、模型组、模型+2.5 mg/kg山茛菪碱组、模型+5 mg/kg山茛菪碱组、模型+10 mg/kg山茛菪碱组共5组（n＝10）。饲养条件：每只大鼠给予24 h昼夜灯光照射控制及严格规范的卡片登记管理，24℃、湿度40%～70%条件下自由摄食饮水饲养，建模前24 h禁食不禁水。模型加药组分别采用尾静脉注射2.5、5、10 mg/kg山茛菪碱[9]，健康对照组和模型组注射等量的生理盐水。6 h后采用Rice-Vannucci法建立HIBD幼龄鼠模型[10]：取模型组和模型加药组大鼠，用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后置于手术台上固定，手术过程控制为无菌环境，颈部消毒，颈部正中切口，剥离颈总动脉，右侧颈总动脉双结扎后切断，手术后将大鼠置于缺氧仓内（仓内环境：8%O2、92%N2、37℃），2 h后进行自然通气。健康对照组只切口并缝合，不结扎颈总动脉和缺氧处理。参照Longa法评价大鼠神经功能损伤[11]，48 h后断头处死大鼠并取脑，部分脑组织用4%多聚甲醛固定，剩余脑组织冻存用于分子实验。

1.2.2 检测脑指数和脑含水率 采用干湿重法测定各组大鼠脑组织脑含水率和脑指数。断头法处死大鼠并取脑，剥去脑膜、小脑和脑干，用0.1 mmol磷酸盐缓冲清洗，滤纸吸干并称取脑质量[12]。取左脑并称取湿质量；随后置于70℃烘箱中干燥24 h，取出并称取其干质量，计算脑含水率、脑指数。脑含水率（%）＝（左脑湿质量-左脑干质量）/左脑湿质量×100%；脑指数（%）＝脑质量/体质量×100%。

1.2.3 HE染色观察脑组织病理损伤 取4%多聚甲醛固定的大鼠脑组织，石蜡包埋切片，切片厚度为3 μm，将切片浸入二甲苯和浓度梯度无水乙醇中60 min进行脱蜡水洗，然后进行苏木精-伊红染色，再将切片放入无水乙醇和二甲苯中透明，中性树脂封片，显微镜下观察组织病理损伤形态学变化并拍照记录。细胞核被染成蓝色，细胞质被染成淡红色或紫色。

1.2.4 TUNEL染色观察脑海马神经元周围组织细胞凋亡 取各组大鼠海马神经元周围组织于4%多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后进行脱水、浸蜡和包埋,严格按照TUNEL试剂盒操作说明书进行染色。阳性细胞即凋亡细胞被染成棕黄色或褐色，非凋亡细胞呈蓝色。1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平 取出预先冻存的大鼠脑组织，室温自然解冻后用手术剪将组织剪切成小块放入研磨仪中研磨均匀，4℃、10000 r/min离心10 min弃上清，用BCA试剂盒测定蛋白总浓度，每孔上样20μg，经SDS-PAGE电泳分离、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔来源的单克隆一抗（1：500），4℃摇床孵育过夜，次日加入HRP标记的对应二抗（1：4000），室温下摇床孵育2 h后，用ECL化学发光试剂于暗室下曝光显影。将胶片整理去色并存档，分析计算各组小鼠蛋白相对表达量。独立重复实验3次取平均值。

1.2.6 RT-PCR检测BDNF和NGF表达水平 取出预先冻存的大鼠脑组织约80 mg，温室解冻组织后置于超声研磨均匀。4℃、12000 r/min离心15 min，用TRlzol试剂盒提取总RNA并测定RNA浓度和纯度。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，按RT-PCR试剂盒操作说明配制反应体系。在PCR扩增仪上进行扩增（扩增条件：保持步骤96℃15 s，40个周期，95℃10 s和60℃30 s），以目的基因和内参比值表示mRNA表达水平，采用2-△△CT法分析结果。独立重复实验3次，取平均值。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：BDNF（390bp）5'-CTTTCATGCAACTGAAGTATGAAA-3'，5'-CCGAC GTGGAGAGCTGAGCGTGTGT-3'。NGF（119bp）5'-CTCTGTCCCTGAAGCCCACTG-3'，5'-TGTTGCGG GTCTGCCCTGTC-3'。β-actin（76bp）5'-ACCCGCG AGTACAACCTTCTT-3'，5'-TATCGTCATCCATGGC GAACT-3'。

1.2.7 试剂盒检测SOD、MDA和GSH含量 取4%多聚甲醛固定的大鼠脑组织，按试剂盒说明进行测定SOD、MDA和GSH-Px含量，4℃、3000 r/min离心15 min，取上清，在96孔板反应孔中加入标准品和待测样本100μl，设置3个复孔。在空白对照孔中加入100μl稀释液，然后在37℃孵育箱中孵育30 min，最后加入酶标抗体进行酶联免疫反应，终止反应后将96孔板放入酶标仪上进行检测。空白孔调零，测定450 nm处各孔的OD值。

1.3 统计分析

使用SPSS 17.0和GraphPad prism 5.0软件分析，正态分布的计量资料表示为均数±标准差（Mean±SD）。多组数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山茛菪碱对HIBD幼龄鼠脑指数和脑含水率的影响

与健康对照组比较，模型组幼龄鼠脑指数和脑含水率升高（P<0.05）。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠脑指数和脑含水率均无明显差异（P＞0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪碱组脑指数和脑含水率降低（P<0.05），见图1。说明山茛菪碱能够缓解HIBD幼龄鼠脑损伤。

图1 脑指数（I）和脑含水率（II）检测统计图A：健康对照组B：模型组C：模型+2.5 mg/kg山茛菪碱组D：模型+5 mg/kg山茛菪碱组E：模型+10 mg/kg山茛菪碱组（图2～5为相同分组）*P<0.05，与健康对照组比较#P<0.05，与模型组比较Fig.1 Statistical diagram of brain index(I)and brain water content(II)A:healthy control group;B:model group;C:model+2.5 mg/kg anisodamine group;D:model+5 mg/kg anisodamine group; E: model + 10 mg/kg anisodamine group；(Thesamegroup A,B,C,D asin Fig.2～Fig.5)*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.2 山茛菪碱对HIBD幼龄鼠脑组织病理损伤的影响

HE染色观察各组幼龄鼠脑组织病理损伤程度，健康对照组脑组织结构正常，未见病理改变。与健康对照组比较，模型组幼龄鼠脑组织结构紊乱，可见胞质空泡化，胞核固缩破裂以及大量炎性细胞浸润。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠脑组织结构紊乱，可见大量炎性细胞浸润，5 mg/kg山茛菪碱组脑组织结构明显改善，可见少量炎性细胞浸润，10 mg/kg山茛菪碱组脑组织结构趋于正常，未见炎性细胞浸润，见图2。结果说明，山茛菪碱能改善HIBD幼龄鼠脑组织病理损伤。

图2 HE染色观察各组幼龄鼠脑组织病理损伤程度Fig.2 HEstaining wasused to observethedegreeof pathological damageto thebrain tissueof young ratsin each group

2.3 山茛菪碱对HIBD幼龄鼠脑神经元细胞凋亡形态学影响

TUNEL染色观察各组幼龄鼠脑神经元细胞凋亡情况及定量分析，健康对照组海马神经元周围组织中未见凋亡细胞。与健康对照组比较，模型组幼龄鼠脑海马神经元周围组织中可见大量褐色或棕黄色阳性细胞，即细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠海马神经元周围组织中仍可见大量凋亡细胞且细胞凋亡率无明显差异，5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪碱组海马神经元周围组织中仅见极少细胞凋亡，凋亡细胞率显著降低（P<0.05），见图3。说明山茛菪碱能缓解HIBD幼龄鼠神经元细胞凋亡。

图3 TUNEL染色观察各组幼龄鼠神经元细胞凋亡Ⅰ:TUNEL染色检测各组幼龄鼠脑神经元细胞凋亡情况Ⅱ:半定量分析各组幼龄鼠脑神经元细胞细胞凋亡率*P<0.05，与健康对照组比较#P<0.05，与模型组比较Fig.3 TUNEL staining was used to observe the neuronal apoptosis of young rats in each groupⅠ:TUNEL staining was used to detect the apoptosis of brain neurons of young rats in each group；Ⅱ:Semi-quantitative analysis of apoptosis rate of brain neuron cellsof young ratsin each group *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vsmodel group

2.4山茛菪碱对HIBD幼龄鼠脑组织中凋亡蛋白表达水平的影响

与健康对照组比较，模型组幼龄鼠脑组织中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠脑组织中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平无明显差异（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠脑组织中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平显著下调（P<0.05），见图4。说明山茛菪碱能缓解HIBD幼龄鼠脑组织细胞凋亡。

图4 Western blot检测各组幼龄鼠脑组织中凋亡蛋白表达水平Ⅰ:Western blot检测各组幼龄鼠脑组织中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平 Ⅱ:半定量分析各组幼龄鼠脑组织中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平*P＜0.05，与健康对照组比较，#P＜0.05，与模型组比较Fig.4 Western blot was used to detect the expression level of apoptotic protein in the brain tissue of young ratsin each groupⅠ:Western blot was used to detect the protein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in the brain tissuesof young ratsin each group；Ⅱ:Semi-quantitativeanalysisof theprotein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in thebrain tissues of young ratsin each group

2.5 山茛菪碱对HIBD幼龄鼠神经功能的影响

与健康对照组比较，模型组幼龄鼠神经功能损伤评分显著增高[11]，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神经营养因子（nerve growth factor，NGF）蛋白及mRNA表达水平降低（P<0.05）。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠神经功能损伤评分、BDNF和NGF均无明显差异（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪碱组神经功能损伤评分显著降低，BDNF和NGF表达水平显著上调（P<0.05），见图5。结果说明，山茛菪碱能够缓解HIBD幼龄鼠神经功能损伤。

图5 各组幼龄鼠神经功能检测I：神经功能损伤评分II：BDNF和NGFmRNA表达水平III、IV：BDNF和NGF蛋白表达水平*P<0.05，与健康对照组比较#P<0.05，与模型组比较Fig.5 Thenerve function of young ratswastested in each group I:Nerve function damage score;II:BDNF and NGF mRNA expression level;III、IV:BDNF and NGF protein expression level *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.6 山茛菪碱对HIBD幼龄鼠氧化应激水平的影响

与健康对照组比较，模型组幼龄鼠脑组织中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量显著升高，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）含量降低，P<0.05。与模型组比较，2.5 mg/kg山茛菪碱组幼龄鼠脑组织中MDA、SOD和GSH-Px含量均无明显差异（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪碱组脑组织中MDA含量降低，SOD和GSH-Px含量增高（P<0.05），见表1。说明山茛菪碱能够减轻HIBD幼龄鼠脑组织中氧化应激水平。

表1 各组幼龄鼠脑组织中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

表1 各组幼龄鼠脑组织中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

*P<0.05，与健康对照组比较#P<0.05，与模型组比较*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

GSH-px（U/ml）97.18±9.75 40.21±5.43*50.32±6.57 69.06±8.19#96.84±10.26#组别Group Control HIBD HIBD+Anis药物剂量（mg/kg）Dose(mg/kg)2.5 5.0 10.0 MDA（mmol/ml）2.21±0.34 5.37±0.46*5.33±0.51 3.59±0.38#2.66±0.34#SOD（U/ml）4.43±0.47 2.08±0.38*2.14±0.21 3.16±0.35#4.29±0.47#

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤发生时，会出现脑组织水肿、选择性神经元坏死、基底神经节大理石样变性、大脑矢状旁区神经元损伤和脑室周围白质转化等[13～15]。本实验通过建立缺氧缺血性脑损伤幼鼠模型，观察各组幼鼠脑指数和脑含水率及病理损伤程度，结果发现，经山茛菪碱药物治疗后，幼鼠缺氧缺血性脑损伤程度明显得到改善，脑指数和脑含水率显著降低。结果提示，山茛菪碱在缺氧缺血性脑损伤幼鼠中具有调节作用。为明确山茛菪碱改善幼鼠缺氧缺血性脑损伤的作用机制，还检测了各组幼鼠脑海马神经元周围组织细胞凋亡水平、脑组织凋亡蛋白和氧化应激水平及神经功能。

海马神经元周围组织细胞凋亡和脑组织细胞凋亡是缺氧缺血性脑损伤的主要病因。Bax、Bcl-2、caspase-9和caspase-3是细胞凋亡过程中重要的调节蛋白，凋亡发生时，凋亡起始蛋白caspase-9诱导并激活下游的凋亡执行蛋白caspase-3，活化的caspase-9和caspase-3进一步启动凋亡级联反应，促使细胞发生DNA裂解及凋亡过程。而Bax和Bcl-2分别为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白并在细胞凋亡过程中发挥作用，Bax/Bcl-2比值通常决定着细胞凋亡水平[16～18]。本研究结果显示，经山茛菪碱药物治疗后，缺氧缺血性脑损伤幼鼠海马神经元周围组织和脑组织中凋亡细胞显著减少，Bax/Bcl-2、caspase-9和caspase-3蛋白表达水平显著降低，表明，山茛菪碱通过抑制脑海马神经元周围组织细胞和脑组织细胞凋亡缓解幼鼠缺血缺血性脑损伤。

神经元细胞由细胞体和细胞突起构成，主要功能是通过接受、整合、传导和输出信息实现信息交换。脑缺氧缺血时，脑神经元受损，机体无法完成正常的信息交换导致神经功能损伤。神经功能受损进一步导致中枢神经系统和周围神经系统不能对生理功能活动进行正常调节，促使继发性脑损伤。脑前额叶脑源性神经营养因子（BDNF）是一种具有神经营养作用的蛋白质，主要在中枢神经系统内表达，通过与酪氨酸激酶B结合而发挥作用，从而促进神经细胞生存和神经发生。神经生长因子（NGF）是最早发现的神经营养因子，广泛存在于各组织器官中，能促进中枢神经和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，能够维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复等[19]。研究表明，脑内移植BDNF和NGF有利于改善缺氧缺血性脑损伤新生大鼠运动和行为记忆能力[20]。本研究结果显示，经山茛菪碱治疗后，缺氧缺血性脑损伤幼鼠神经功能显著好转，BDNF和NGF表达水平显著增高，提示山茛菪碱对缺氧缺血性脑损伤幼鼠脑神经功能具有保护作用。

氧化应激与多种生理病理过程密切联系，正常情况下，机体内氧化与抗氧化处于动态平衡，缺氧缺血性脑损伤发生时，缺氧导致脑组织中产生的大量氧自由基不能被清除，氧化与抗氧化动态平衡被打破，从而损坏脑组织正常功能，加重脑组织损伤。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，过量的MDA能够促进膜损伤和氧化过程，通常MDA含量反映脂质过氧化程度及细胞损伤程度。超氧化物歧化酶（SOD）则与之相反，SOD是一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是一种重要的过氧化物分解酶，能够保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的损害[21～23]。本实验结果显示，经山茛菪碱治疗后，缺氧缺血性脑损伤幼鼠脑组织中MDA含量显著降低，SOD和GSH-Px含量显著升高。结合前期结果可知，山茛菪碱通过调节缺氧缺血性脑损伤幼鼠脑组织氧化应激缓解幼鼠脑损伤。

综上所述，山茛菪碱能够缓解缺氧缺血性脑损伤幼龄鼠脑组织形态和神经功能损伤，其作用机制与抑制脑细胞凋亡，促进神经功能因子表达，调节氧化应激水平有关。