添加矿质元素对灵芝菌株G8液体培养产漆酶的影响*

刘静雯，黄 亮，班立桐，孙 宁，王 玉，杨 艳

（天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

灵芝（Ganoderma lucidum）作为一种名贵中药用于临床已有悠久的历史，具有扶正固本[1]、滋补强壮、抗肿瘤[2]、抗放射、提高免疫力的功效。近年来关于灵芝产漆酶的研究越来越多[3]，与动物来源的漆酶相比，真菌漆酶具有更好的热稳定性、更强的金属耐受性及底物催化活性[4]。

与固体菌种相比，灵芝液体发酵培养周期短、工艺简便[5]。金属元素对真菌细胞生长、次生代谢产物合成具有显著影响。李宇伟等[6]研究表明，0．2%的Fe2+对提高灵芝多糖含量有明显效果。鲍锐等[7]研究结果表明，加入100μmol·L-1硫酸铜时，灵芝酸产量较对照组提高57%。蔡爱群等[8]发现在浓度为200 mg·L-1～1 200 mg·L-1时，随着 Ca2+浓度的增加，赤芝的生物量逐渐减少。

通过对灵芝菌株泰山灵芝G8的培养条件进行优化，考察 Fe2+、Cu2+、K+、Mg2+、Ca2+对菌株 G8 液体培养过程中产漆酶的影响，为灵芝的资源开发利用提供参考，促进药用真菌产业的发展。

1 材料与方法

1.1 菌种

灵芝菌株泰山灵芝G8（以下简称菌株G8），保藏于天津农学院食用菌研发中心。

1.2 培养基

液体菌种培养基：KH2PO40.46 g、K2HPO41 g、玉米粉1%、葡萄糖20 g、酵母浸粉15 g。

1.3 试验方法

1.3.1 菌丝生长曲线的测定。

接种后静置1 d，然后置于25℃、140 r·min-1的摇床培养。于第3天开始每天取样，记录菌丝干重。以培养时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制菌丝生长曲线，并根据生长曲线测定取样时间。

1.3.2 菌种培养条件筛选

1）静置时间对菌株G8液体培养速率的影响

在转速140 r·min-1条件下，设置不同静置时间梯度，依次为 0、8 h、16 h、24 h、32 h。培养7 d后，测定菌丝体干重。

2）不同装液量对菌株G8生长速率的影响

在转速140 r·min-1、静置时间24 h条件下，采用250 mL三角瓶进行试验，设置不同装液量梯度，依次为 50 mL、70 mL、90 mL、100 mL、110 mL。培养7 d后测定菌丝体干重。

3）不同pH对菌株G8生长速率的影响

在转速为140 r·min-1、静置时间24 h、装液量90 mL条件下，设置不同pH梯度，依次为4、5、6、7、8，培养7 d后，测定菌丝体干重。

1.3.3 单因素试验

培养基中添加不同浓度的矿质元素，分别为FeSO4：0、0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1；CuSO4：0、0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.15 g·L-1；KCl：0、0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1；MgSO4：0、0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、2.0 g·L-1；CaCO3：0、0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1。

每个处理3次重复试验。于25℃静置24 h，pH 5，装液量90mL，转速为140 r·min-1的条件下培养灵芝G8菌丝，第7天取样测定漆酶的吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算酶活力。

1.3.4 正交试验设计

根据单因素筛选试验以KCl、CuSO4、CaCO3、MgSO4为因素，设计L9（34）的正交试验，正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计Tab.1 Factors and levels design of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 灵芝菌丝生长曲线

菌株G8菌丝生长情况见图1。

图1 菌株G8生长曲线Fig.1 Growth curve of strain G8

如图1所示，根据泰山灵芝G8菌丝生长曲线,确定最佳取样时间为第7天。

2.2 静置时间对灵芝液体培养速率的影响

不同静置时间对菌株G8液体培养速率的影响结果见图2。

图2 不同静置时间条件下菌丝干重Fig.2 The dry weightofmycelium under different standing time conditions

由图2可知，随着静置时间的延长，菌丝干重先升高后降低。静置时间为24 h的摇瓶中菌丝干重最大为2.33 g·L-1，因此根据试验结果确定静置时间为24 h时最佳。

2.3 装液量对灵芝生长的影响

不同装液量对菌株G8生长的影响试验结果见图3。

图3 不同装液量条件下菌丝干重Fig.3 The dry weightofmycelium under different liquid medium volume conditions

由图3可知，随着装液量的增加，菌丝干重呈现先升高后降低的趋势。当装液量为90 mL时摇瓶中溶氧量高，菌丝代谢旺盛，菌丝干重达到最大；但装液量过大时反而影响摇瓶中的溶氧量，从而导致菌丝生长缓慢。因此最佳装液量为90mL。

2.4 pH条件对灵芝生长的影响

pH影响菌丝体的新陈代谢，从而影响菌丝生物量的高低[9]，不同pH对菌株G8生长的影响试验结果见图4。

图4 不同pH条件下菌丝干重Fig.4 The dry weightofmycelium under different pH conditions

由图4可知，随着pH的增加，菌丝干重呈先升高后降低的趋势。pH为5时菌丝干重达到6.864 g·L-1，显著高于其他处理；pH为6时摇瓶中菌丝干重显著下降，这与姚良同等[10]试验结果相同。故筛选出的最佳pH为5。

2.5 矿质元素对漆酶酶活性的影响

MgSO4、CaCO3、FeSO4、CuSO4和 KCl对漆酶酶活性的影响单因素试验结果见图5～图9。

图5 MgSO4对漆酶酶活的影响Fig.5 EffectofMgSO4 on laccase activity

图6 CaCO3对漆酶酶活的影响Fig.6 Effectof CaCO3 on laccase activity

图7 FeSO4对漆酶酶活的影响Fig．7 Effectof FeSO4 on laccase activity

图8 CuSO4对漆酶酶活的影响Fig．8 Effectof CuSO4 on laccase activity

图9 KCl对漆酶酶活的影响Fig．9 Effectof KCl on laccase activity

如图5～图9所示，漆酶酶活在MgSO4添加量为0．5 g·L-1时最大；漆酶酶活随CaCO3添加量增加而提高，在添加量达到0．2 g·L-1时达最大值；漆酶酶活随着Fe2+浓度的增加逐渐降低，说明Fe2+对灵芝漆酶酶活性有抑制作用，这与沈柯宇[11]的研究结果相同；漆酶酶活在CuSO4添加量为0．1 g·L-1时达到最大值；K+对漆酶酶活具有一定的激活作用[12]，漆酶酶活在KCl添加量为0．05 g·L-1时达到最大值。

2.6 正交试验结果分析

正交试验R值的大小反映该因子对试验结果的影响程度，分析结果见表2。

表2 正交试验结果分析Tab．2 Analysis of orthogonal test results

如表2所示，正式试验影响试验结果的各因素顺序为：MgSO4>KCl>CaCO3>CuSO4。最佳组合为A3B3C2D2， 即 为 KCl 0．1 g·L-1、 CuSO40．15 g·L-1、CaCO30．2 g·L-1、MgSO40．5 g·L-1。

正交试验结果的方差分析见表3。

表3 正交试验方差分析表Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

如表3所示，结果表明KCl、MgSO4对菌株G8液体培养漆酶酶活性具有显著性差异。

2.7 验证试验结果分析

验证试验结果表明，菌株G8液体培养产漆酶的酶活最佳培养基配方为A3B3C2D2，即90 mL培养基添加矿质元素含量为 KCl 0．1 g·L-1、CuSO30．15 g·L-1、CaCO30．2 g·L-1、MgSO40．5 g·L-1，漆酶的酶活为72．28 U·L-1。

3 结论与讨论

静置时间对灵芝生长有一定影响，不静置与静置16 h和24 h之间的差异也较明显。不同装液量对菌株G8的生长影响相对较小，装液量100mL的菌丝干重低于装液量50 mL，装液量的多少直接影响溶氧水平[13]，不同浓度氧气条件下菌丝干重变化同样受到影响[14]；在低于100 ml装液量时，灵芝的生长情况随装液量的增加而提高；在装液量为90 mL时菌丝干重达到最大值，与慕春歌等[15]最佳装液量为120mL的研究结果不同，其差异性可能是由于菌种与液体培养基成分的不同所引起。不同pH对菌株G8的生长情况影响较大，当pH为5时与菌株G8生长曲线相比，菌丝干重提高了近50%，由此得出菌株G8为偏酸性菌。

已有研究报道发现，灵芝菌株产漆酶能力与培养条件存在一定关联[16]，优化培养基碳源、氮源、添加外源物质等，均会对灵芝菌株漆酶活性产生影响[17-18]，不同的矿质元素作为外源物质对灵芝漆酶酶活产生的影响不同，且矿质元素对漆酶活性的影响与其离子浓度有关，矿质元素不仅可以增加漆酶的表达量，还可以提高其活性。在本研究中，5种矿质元素不同程度的增加或抑制了灵芝漆酶的活性。将单因素试验与正交试验相结合，筛选出最佳产漆酶培养基矿质元素添加量为KCl 0.1 g·L-1，CuSO40.15 g·L-1，CaCO30.2 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，此时漆酶活力最高值为72.28 U·L-1，与优化前相比提高了28%。

在工厂规模化生产中，主要靠发酵罐实现液体菌种的培养。通过摇瓶培养确定了可供参考的菌株G8生产的液体培养及产漆酶条件，而发酵罐和摇瓶的培养条件差异较大，且矿质元素种类众多，不同的矿质元素对漆酶活性的影响效果不一致，因此还需进一步开展发酵罐培养条件与其他矿质元素对漆酶酶活的影响试验研究。