珠芽黄魔芋组织培养与快繁技术研究

杨宝明，苏 艳，李永平，杨超振，黄玉玲，李迅东，尹可锁，王丽花，张艺萍

（1.云南省农业科学院农业环境资源研究所 云南省农业跨境有害生物绿色防控重点实验室，云南昆明 650205；2.云南省农业科学院花卉研究所 农业农村部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650205；3.云南省农业科学院热区生态农业研究所，云南元谋 651300）

珠芽黄魔芋是20 世纪90年代在东南亚等周边国家热带森林中野生混合珠芽魔芋（Amorphophal⁃lus bulbifer）群体中发现并引种驯化栽培的一个魔芋新品种[1-4]。珠芽黄魔芋适种范围广，可与其他高杆作物间种；耐高温和高湿，适于热带和亚热带地区种植，生长速度快、产量高、品质好且抗病性强。目前，其在云南德宏傣族景颇族自治州、西双版纳傣族自治州、临沧市和普洱市等地的种植规模不断增加[5-9]，并有推广种植的趋势[10]。随着珠芽黄魔芋种植面积不断扩大，用种需求不断增加，种芋供给成为制约珠芽黄魔芋产业发展的瓶颈。传统的块茎切块繁殖方法增殖速度慢、繁殖系数低、块茎用量大，实际生产中还会传播病害[11-13]。应用植物组织培养技术，开展珠芽黄魔芋组培快繁技术研究，建立无性快繁体系，在短时间内提供大量优质种芋，是缓解种芋供给问题的关键。有关珠芽魔芋组培技术的研究已有较多报导[13-16]，但珠芽黄魔芋该方面的研究较少，主要以叶柄为外植体[17]。珠芽黄魔芋属于三倍体，有一定的特殊性，在其离体培养中存在外植体灭菌不彻底、污染率高、前期培养污染严重和无菌繁殖体系建立困难等问题，严重制约珠芽黄魔芋种苗的规模化生产。本研究以珠芽黄魔芋地下块茎为外植体，开展外植体灭菌、愈伤组织诱导、不定芽增殖及生根壮苗试验，筛选最佳组培快繁方法，以实用、高效和稳定的方法实现珠芽黄魔芋植株再生。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在云南省西双版纳傣族自治州农业科学研究所试验田（100°77'E，22°00'N），选择生长健壮、长势良好且无病虫害的珠芽黄魔芋地下块茎为外植体，块茎表面无虫眼和病斑。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体处理

用自来水将块茎表面泥土冲洗干净，并用洗衣粉刷洗表面，再用自来水冲洗20～30 min。

1.2.2 外植体灭菌

在无菌工作台上，用手术刀将块茎切成2 cm×2 cm×2 cm 左右的小块，用浓度为75%的酒精溶液浸泡30 s 后，分别按A1、A2、A3和A4四种方法进行灭菌处理（表1）。用无菌滤纸吸干表面水分，切除四周褐化组织。将灭菌后的外植体切成1 cm×1 cm×1 cm 左右小块，接种至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培养基中，每处理接种5 瓶，每瓶接种1 块，3 次重复。培养5 天后，每3 天观察污染情况1次，30天计算污染率及褐化率。

表1 灭菌方法Tab.1 Sterilization methods

1.2.3 培养条件

基本培养基（MS）为蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，pH值为5.8～6.0。培养温度为（25±2）℃，光照时间为每天12 h，光照强度为1 600～2 000 lx。

1.2.4 愈伤组织诱导培养

愈伤组织诱导培养基为B1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B2：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B3：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B4：MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；B5：MS + 6-BA 1.5 mg/L +NAA0.5 mg/L；B6：MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5mg/L。

将经0.3%害剋溶液灭菌40 min 和0.1% HgCl2溶液灭菌5 min 处理后的外植体切成1 cm × 1 cm ×1 cm 左右小块，分别接种至愈伤组织诱导培养基中，每处理接种5 瓶，每瓶接种1 块，3 次重复。培养5 天后，每3 天观察生长情况1 次，30 天统计出愈块数并计算愈伤组织诱导率。

1.2.5 不定芽增殖培养

不定芽增殖培养基为C1:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C2：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C3：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C4：MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；C5：MS + TDZ 0.05 mg/L +NAA 0.2 mg/L；C6：MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C7：MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

将培养得到的愈伤组织切成0.5 cm × 0.5 cm ×0.5 cm 左右小块，接种至不定芽增殖培养基中，每处理接种5 瓶，每瓶接种1 块，3 次重复。培养30 天计算不定芽增殖系数。

1.2.6 生根壮苗培养

生根壮苗培养基为D1：MS+NAA 0.3 mg/L；D2：MS+NAA 0.4 mg/L；D3：MS+NAA 0.5 mg/L；D4：MS+IBA 0.5 mg/L；D5：MS+IBA 0.8 mg/L。

将增殖培养得到的高度为3～4 cm 的小苗从基部分割成单株，接种至生根壮苗培养基中，每处理接种5瓶，每瓶接种10株，3次重复。培养30天统计根数、测量株高并计算生根率。

1.3 数据处理

采用SPSS 统计分析软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 灭菌处理的灭菌效果

不同灭菌处理的外植体接种后，3～4 天开始陆续发生污染，20 天左右污染趋于稳定。不同灭菌处理的污染率差异显著（P<0.05）（表2）。4 种处理的污染率分别为73.3%、53.3%、26.7%和20.0%，随着灭菌时间的延长而降低；褐化率分别为25%、28.5%、9.0%和8.3%。A4处理的污染率和褐化率最低，为较适合珠芽黄魔芋块茎的灭菌处理。

表2 不同处理对外植体灭菌效果的影响Tab.2 Effects of different treatments on sterilization of explants

2.2 不同处理对愈伤组织诱导的影响

无菌外植体在B1～B6培养基中培养12～18 天，基部开始膨大，25 天左右切口处开始产生愈伤组织，35 天左右愈伤组织形成瘤状突起。各培养基的愈伤诱导率均差异极显著（P<0.01）；随着6-BA 和NAA 浓度的增加，愈伤诱导率增加，外植体膨大启动时间缩短（表3）。6种培养基中，B6的愈伤诱导率最高（93.0%）、外植体膨大启动时间最短（12 天），为愈伤组织诱导最佳培养基。

表3 不同处理对愈伤组织诱导的影响Tab.3 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同处理对不定芽增殖的影响

在C1～C7不定芽分化增殖培养基中培养35～40天，可获得叶柄高度0～6.1 cm 的小苗。7种培养基均能诱导不定芽分化，平均增殖系数和不定芽的叶柄长均差异极显著（P＜0.01）（表4）。TDZ 促进不定芽分化的作用大于6-BA，添加TDZ 的培养基最高增殖系数可达9.73，但存在叶柄短、叶片小、芽点多和芽密集等问题，当使用浓度高于0.20 mg/L时，会出现不定芽畸形、鳞片肥大和扭曲及无叶片等情况。从总体结果来看，6-BA 更适合不定芽增殖；NAA 浓度相同时，随着6-BA 浓度的增加，增殖系数先增后降；6-BA 浓度为2.5 mg/L 时，增殖系数最大（8.67）。诱导不定芽增殖的最佳培养基为C3，其次为C2。

表4 不同处理对不定芽增殖的影响Tab.4 Effects of different treatments on adventitious bud proliferation

2.4 不同处理对不定芽生根的影响

各培养基均能诱导不定芽生根，生根率和平均根数均差异极显著（P< 0.01）（表5）。添加NAA 的培养基生根较快，接种20 天左右开始生根，根系多且粗壮；添加IBA 的培养基生根较慢，接种23 天左右开始生根，根系较少。D3处理的生根效果最好，生根率最高（92.0%），生根时间最短（20 天），平均根数最多（7.23），为最佳生根培养基。

表5 不同处理对不定芽生根的影响Tab.5 Effects of different treatments on adventitious bud rooting

3 讨论与结论

在组织培养中，外植体的灭菌效果直接影响无性繁殖，也是组培成败的关键因素之一。外植体灭菌既要考虑灭菌效果，又要兼顾外植体的损伤程度及其再生能力，应选用适宜的灭菌方法以达到降低污染率、减小外植体损伤的目标。本研究结果显示，单独使用HgCl2溶液，灭菌效果不佳，随灭菌时间的延长，褐化率升高；0.3%害剋溶液与0.1%HgCl2溶液配合使用缩短了HgCl2的使用时间，降低了外植体褐化率，污染率明显低于单独使用HgCl2溶液的处理。0.3%害剋溶液灭菌40 min 和0.1% HgCl2溶液灭菌5 min为珠芽黄魔芋块茎的最佳灭菌方法。

激素的种类、浓度和配比也是影响组培的关键因素。在珠芽黄魔芋愈伤组织诱导中，增加6-BA和NAA 浓度，可促进愈伤组织形成，提高愈伤诱导率，愈伤组织形成早，生长快，最佳培养基为MS +6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L。在珠芽黄魔芋增殖培养中，NAA 浓度相同时，TDZ 对不定芽增殖的促进作用大于6-BA，但存在不定芽多、芽密集、植株矮和叶柄短等问题，不利于生根壮苗。6-BA 浓度为1.5～2.5 mg/L 时有利于不定芽增殖，芽丛粗壮且整齐；当6-BA 浓度为3.0 mg/L 时，不定芽增殖率降低，说明6-BA 浓度过高或过低均不利于不定芽的形成；最佳增殖培养基为MS + 6-BA 2.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。在生根培养中，NAA促进生根的效果明显好于IBA，最佳生根培养基为MS+NAA 0.5 mg/L。该技术已在种苗生产上应用，基本解决了外植体灭菌不彻底、污染率高、褐化率高和前期培养污染严重等问题，增加了增殖系数，对种苗生产和相关研究有参考及指导意义。