25羟基维生素D3和维生素D3对荷斯坦种公牛精液品质和血清生化指标的影响

冯冠智 徐宏建 王丽华 张城瑞 祖智富 张永根*

(1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.上海奶牛育种中心有限公司，上海 200436)

目前，人工授精技术在家畜育种和遗传改良中起着至关重要的作用[1]。精液品质反映公畜的繁殖性能并决定着人工授精成功与否，因此要提高精液品质，从而提高人工授精的成功率。荷斯坦种公牛的繁殖力是影响我国奶牛繁殖性能和牧场盈利的重要因素。钙和磷主要分布在动物骨骼中，是动物正常生长繁育必不可缺少的元素。而维生素D3能够增加钙和磷的吸收率，调节动物体内的钙和磷的稳态，提高精液品质，促进生殖器官发育；能够增加骨骼硬度与强度，从而增加动物骨骼矿物质元素沉积，减少骨质疏松和骨软化症的发生，减少肢蹄疾病的产生，从而减少荷斯坦种公牛的淘汰率及减少企业的经济损失。

种公牛在生产过程中由于氧化应激会产生活性氧自由基，活性氧自由基显著影响睾丸功能、睾酮水平和精母细胞凋亡，自由基的积累可导致种公牛繁殖能力受到损伤。精液生成过程中活性氧自由基的增加会破坏精子的超微结构和功能，导致其形态学、运动性和染色质结构的破坏。活性氧的产生破坏了精子的线粒体膜，导致种公牛精子发生损伤。因此，提高公牛精液的抗氧化能力具有十分重要的意义。

维生素D3是维生素D的一种非活性形式，它是紫外光与7-脱氢胆固醇反应的产物[2]。维生素D3产生后首先在肝脏线粒体和微粒体中发生羟基化，生成25羟基维生素D3。血液循环中25羟基维生素D3在肾脏中经1α-羟化酶羟化生成1,25二羟维生素D3。使用25羟基维生素D3可以有效提高血液25羟基维生素D3和钙、磷含量，减少钙磷代谢异常从而有效保证了家畜的骨骼发育[3]。近年来，随着对维生素D3研究的不断深入，维生素D3的诸多功能不断被发现，例如抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等特性。研究表明，维生素D缺乏会损害动物和人类精液品质[4]。饲喂高剂量维生素D3可提高血清25羟基维生素D3含量以及改善育种公猪精子质量，提高激素水平。血浆25羟基维生素D3含量是反映动物机体维生素D3状况的最好指标[5]。25羟基维生素D3的吸收效率和体内代谢活性均高于维生素D3，因此直接饲喂25羟基维生素D3会更有利于机体直接吸收，从而使精液品质提高。曹令勤等[6]研究报道，25羟基维生素D3有效缓解了繁殖后期种公鸡应激，提高了机体对营养物质的代谢吸收，从而提高了精子密度、精子活力及有效精子数，改善种公鸡的精液品质。董洪俊[4]研究报道，种公猪饲粮中添加25羟基维生素D3能更有效增加血浆维生素D含量，从而改善精子的形态和运动能力，提高公猪的繁殖性能。

维生素D3水平与种公牛的繁殖能力有关。然而，有关25羟基维生素D3对荷斯坦种公牛的精液品质和健康影响的研究却鲜有报道。因此，本研究的目的是探究：1)25羟基维生素D3替代维生素D3是否能够改善种公牛的精液品质；2)25羟基维生素D3替代维生素D3对种公牛钙磷代谢调节、激素分泌和抗氧化能力是否有促进作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮

所有动物试验操作均按照东北农业大学动物保护委员会的原则和操作指南进行(编号：NEAU-[2011]-9)。本试验在上海奶牛育种中心进行。试验选取16头荷斯坦种公牛(24～36月龄)，根据体重和精子活力随机分为2个处理：1)饲粮添加维生素D3(300 IU/kg)，2)饲粮添加25羟基维生素D3(300 IU/kg)。试验期为60 d。公牛被拴系在单独的围栏里，围栏上配有自动饮水器。在相同的光照条件下。每天于07：00和13：30饲喂2次。自由采食。每天调整给料量，以达到至少5%的剩料量。每周二于08:30进行采精1次。

基础饲粮组成及营养水平如表1所示，精料由光明牧业有限公司配制。25羟基维生素D3由山东某生物工程有限公司提供(产品含量20 000 IU/g)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 精液采集与质量评价

于试验期第60天08：30用预热过的人工阴道采集精液。采集后，分别用量杯法和血球计法测量精液体积和密度[7]。将精液滴在预热过的显微镜载玻片上，用光学显微镜盖上覆盖物，以评估精子的运动能力[8]。用伊红-黑素染色法观察精子的活力和异常情况[9]。玻片用精液、伊红和黑精混合染色法涂片。对载玻片中的200个精子进行计数，分为活精子(未染色)和死精子(完全或部分染色)。载玻片进一步检查精子异常：头部异常、尾部异常、中段异常、头部脱落、尾部盘绕。按照Chinoy等[10]硝酸银染色法评价精子顶体完整性。按照Revell等[11]采用低渗透肿胀试验评估精子质膜完整性。

采集精液，转入精浆分离管中。于1 500×g离心15 min，分离精浆，收集上清，再于14 000 r/min，离心10 min，分离剩余精子。精浆在-20 ℃冷冻保存，待分析。精浆超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性，总抗氧化能力及丙二醛、还原型谷胱甘肽含量使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所)，按说明书方法测定。按照Martinez等[12]采用原子吸收方法测定精浆钙和镁含量。精浆磷含量采用钼蓝法[13]测定。

1.3 血液采集与分析

于试验第60天晨饲后3 h经尾静脉采血，使用不含抗凝血剂的真空管进行血清分离(3 000×g离心15 min)。原子吸收法测定血清钙和镁含量。采用钼蓝法测定血清磷含量。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中25羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D3含量(华英生物技术研究所测定)。采用放射免疫试剂盒对血清17β-雌二醇、睾酮、皮质醇和生长激素含量进行分析(华英生物技术研究所测定)。采用比色法分析试剂盒(南京建成生物工程研究所)分析血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，总抗氧化能力及丙二醛、还原型谷胱甘肽含量。

1.4 数据处理与分析

本试验数据处理采用SAS 9.4统计软件的PROC GLM模块对精液品质、激素分泌、矿物质代谢进行数据分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液品质的影响

由表2可知，与添加维生素D3相比，添加25羟基维生素D3存在增加种公牛精子密度的趋势(0.050.05)。

表2 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液品质的影响

2.2 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液抗氧化能力和钙、磷、镁含量的影响

由表3可知，与添加维生素D3相比，饲粮添加25羟基维生素D3显著提高种公牛精浆的还原型谷胱甘肽含量(P<0.05)，显著降低丙二醛含量(P<0.05)，且超氧化物歧化酶活性有提高趋势(P=0.07)。与添加维生素D3相比，饲粮添加25羟基维生素D3显著提高精浆中钙含量(P<0.05)，但添加25羟基维生素D3对精浆中磷和镁含量无显著影响(P>0.05)。

表3 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液抗氧化能力和钙、磷、镁含量的影响

2.3 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清钙、磷、镁和维生素D3代谢物含量的影响

由表4可知，与添加维生素D3相比，饲粮添加25羟基维生素D3显著增加种公牛血清钙含量(P<0.05)，极显著提高血清磷含量(P<0.01)；饲粮添加25羟基维生素D3极显著提高种公牛血清25羟基维生素D3和1,25二羟维生素D3含量(P<0.01)。

表4 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清钙、磷、镁和维生素D3代谢物的影响

2.4 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清激素含量的影响

由表5可知，与添加维生素D3相比，饲粮添加25羟基维生素D3显著提高血清睾酮、17β-雌二醇含量(P<0.05)；显著降低血清皮质醇含量(P<0.05)。

表5 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清激素含量影响

2.5 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清抗氧化功能的影响

由表6可知，与添加维生素D3相比，饲粮添加25羟基维生素D3显著降低血清丙二醛含量(P<0.05)，显著提高血清还原型谷胱甘肽含量和过氧化氢酶活性(P<0.05)。

表6 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清抗氧化功能的影响

3 讨 论

3.1 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液品质的影响

精液体积和精子密度数值的增加可能是由于血清雌二醇和睾酮含量的增加促进了生殖细胞、副性腺和睾丸组织的发育。Arab等[14]研究表明，维生素D可通过生殖器官和精母细胞上的维生素D受体发挥其生理作用。成熟精子颈部存在维生素D受体和代谢酶，这表明维生素D可能与精子发生与成熟存在相关性。饲粮添加25羟基维生素D3增强精子动力和顶体酶活性，可能是精液中25羟基维生素D3含量增加提高了精子颈部和头部的钙含量，从而增加精子能动性，这与Bedu-Addo等[15]研究结果基本一致。李亮亮等[16]研究结果表明了，精子存活率的增加可能是睾酮能够维持生精并延长附睾中精子的寿命。此外，精子膜的完整性对脂质过氧化反应高度敏感，而活性氧是精液产生过程中有害的物质，它可以破坏精子的质膜，进而破坏细胞膜和核酸，因此精子膜完整率的增加归因于精浆抗氧化能力的增强。Merino等[17]和Lin等[18]研究认为，25羟基维生素D3缺乏对精液质量、睾丸发育和精子产生负面影响。精液中25羟基维生素D3含量增加有可能改善种公猪的精子质量和膜完整性，这与本试验结果一致。

3.2 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛精液抗氧化能力和钙、磷、镁含量的影响

精浆是由各种附属腺体联合分泌的液体组成的。精浆中抗氧化酶和矿物质可以防止氧化损伤并且与精子的存活率和精子获能有关[19]。本试验结果表明，在种公牛饲粮中添加25羟基维生素D3有助于提高精浆的抗氧化能力，这可能是精液中1,25二羟基维生素D3的疏水部分保护膜免受氧化的原因。种公牛精浆抗氧化酶活性的提高以及丙二醛含量的降低，这与Mukhopadhyay等[20]研究结果相似，25羟基维生素D3作为细胞抗氧化剂防止鼠淋巴瘤发生时发现，25羟基维生素D3可提高谷胱甘肽氧化酶和还原酶类活性。精子的抗氧化能力是有限的，种公牛必须借助有效的内部抗氧化剂来防止自身的氧化损伤。因此，精浆中抗氧化酶是至关重要的，因为它们能将氧化自由基控制在生理范围内并保护精子。饲粮中添加25羟基维生素D3对种公牛精液品质的改善可能是由于抗氧化能力的增强保护精子免受氧化损伤所致。

饲粮添加25羟基维生素D3增加了种公牛精浆中钙含量，这可能是因为睾丸生殖细胞和间质细胞对钙的吸收并转移至精液中。在正常范围内增加钙和磷含量有利于维持机体正常生理功能。然而，由钙介导的维生素D3功能与繁殖性能之间的相关性的重要性往往被忽视。事实上，维持精液中的钙含量比血清钙含量对精子活力更重要。当精浆中的钙含量比血清高2～3倍时，维生素D受体可以激活男性生殖道中活性钙离子运输从而增强精子活力[21]。

3.3 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清钙、磷、镁和维生素D3代谢产物含量的影响

成年奶牛血液中正常钙含量为2.2～2.5 mmol/L，而磷在血液中正常含量为1.3～2.6 mmol/L，本试验血清中钙和磷含量均处于正常范围内，饲粮添加25羟基维生素D3的种公牛血清钙和磷含量显著高于添加维生素D3。维生素D可促进骨中钙、磷释放入血，促进肾小管对钙磷的重吸收作用，在小肠黏膜细胞中与特异的受体蛋白相结合从而增加了运钙蛋白的合成，提高血清钙、磷含量。与Martinez等[22]研究结果相同，饲粮添加25羟基维生素D3提高血清25羟基维生素D3、钙和磷含量。正常奶牛血液中25羟基维生素D3含量为40～100 ng/mL。在本试验中，饲粮添加维生素D3种公牛血清25羟基维生素D3含量在正常范围内，而饲粮添加25羟基维生素D3种公牛血清25羟基维生素D3含量是饲粮添加维生素D3种公牛的2倍，这与Celi等[23]研究表明一致，饲喂生长犊牛25羟基维生素D3显著提高了血清和组织中25羟基维生素D3和1,25二羟基维生素D3含量。总磷含量的增加抑制了1α-羟化酶活性，尽管抑制了1α-羟化酶合成1,25二羟基维生素D3，但添加25羟基维生素D3仍能显著提高公牛血清1,25二羟基维生素D3的含量[24]。25羟基维生素D3羟基化为1,25二羟基维生素D3也发生在肾脏以外的细胞组织中，如上皮细胞、睾丸间质细胞以及免疫细胞[25]。血清中25羟基维生素D3含量的增加改善了精液质量和性激素分泌，这可能是由于25羟基维生素D3为间质细胞中1,25二羟基维生素D3的合成提供了充足的底物。

3.4 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清激素含量的影响

睾酮调节生殖细胞分化是睾丸正常发育和精子发生的先决条件。与添加维生素D3相比，摄入25羟基维生素D3的种公牛血清睾酮含量更高，这与Lin等[18]研究报道一致，维生素D对精液品质的调控作用可能与其提高血浆睾酮含量有关。Hofer等[26]研究表明，睾酮合成酶对睾丸间质细胞的睾酮合成起着关键作用，它主要是由17β-羟类固醇脱氢酶、3β-羟基类固醇脱氢酶以及CYP11A1和CYP17A1基因调控的雄激素组成的，1,25二羟基维生素D3刺激了人肾上腺皮质细胞的CYP11A1和CYP17A1的合成，从而促进了睾酮合成酶产生，提高了血清睾酮的含量。雌二醇在精子发生过程中起着重要作用，包括精细胞的增殖、分化和最终的成熟，以及存活和凋亡。被1,25二羟基维生素D3激活的维生素D受体对啮齿动物生殖器官的雌激素合成具有直接的调节作用，这与Keiko等[27]研究结果一致。Weerakoon等[28]研究报道，肉牛血液中较低的雌二醇含量抑制了精液繁殖能力。而且精子活力可能与血清雌二醇含量呈正相关[29]。此外，更多的雌二醇能够促进青年肉牛睾丸的发育[30]。

本研究结果表明，饲喂25羟基维生素D3可以降低成年公牛的血清皮质醇含量，这与王可宝[31]研究报道一致。Weerakoon等[28]研究报道，较高的血清皮质醇含量会导致青年公牛精液异常。公牛体内皮质醇含量的增加抑制了睾酮的分泌[32]。血清皮质醇含量的变化可能会因动物的应激和动物的性情而有所不同[33]。但在试验期间，只允许2名训练有素的工作人员管理动物和取样，尽量减少种公牛的应激。

3.5 不同形式维生素D3对荷斯坦种公牛血清抗氧化功能的影响

维生素D3缺乏对氧化应激和抗氧化标志物存在负面影响。维生素D3有可能改善家畜的抗氧化功能[34]。Yang等[35]研究发现，饲粮中添加25羟基维生素D3可提高断奶仔猪血清谷胱甘肽含量、过氧化氢酶活性并且降低丙二醛含量，这与本试验结果相同。此外，血清1,25二羟基维生素D3可能是潜在的膜抗氧化剂，因为它通过其疏水部分保护膜免受脂质过氧化[36]。

4 结 论

与添加同等水平维生素D3相比，种公牛饲粮中添加25羟基维生素D3能更有效地增加精浆钙含量以及抗氧化能力，从而提高精子的活力和存活率，改善种公牛的精液质量，并能够提高血清中钙、磷和25羟基维生素D3以及睾酮和雌二醇含量，改善种公牛的抗氧化状态。