番茄叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及Pti互作蛋白筛选

王 洋, 王莹莹, 张 政, 冯国栋, 周 宇, 牛向丽

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

蛋白质作为大多数基因编码的最终产物,负责细胞内主要生物过程。它们可以单独行使功能,更多的是与其他蛋白质通过相互作用,彼此之间密切协调建立复杂的关联网络,共同维持生物体的正常生命活动。因此,蛋白质相互作用网络的阐明是生物学的一个重要研究内容。目前,蛋白质与蛋白质相互作用的实验检测方法有多种,其中20世纪90年代兴起的酵母双杂交技术,仍是研究蛋白质互作的有效手段之一[1]。这种技术是基于真核生物转录因子具有2个可分离的结构域，即DNA结合结构域(binding domain,BD)和激活结构域(activating domain,AD)。DNA结合结构域负责转录因子识别结合于特定基因组DNA序列,而激活结构域则促进所识别特定基因的转录。通过检测蛋白质之间的相互作用,可以使BD、AD结构域接近而激活下游报告基因的表达[2],由此利用报告基因的表达检测与某一蛋白质(诱饵)发生相互作用的蛋白质(猎物)[3]。在过去的几十年中,酵母双杂交技术不仅用于检测已知蛋白质间的互作,还被应用于筛选各种基因文库,通过从酵母文库中批量筛选获得与已知蛋白互作的未知蛋白,极大降低了大规模库筛选的成本和人力[4-5],进而用于探究蛋白质之间的作用网络及其所调控的生命活动。

番茄抗病蛋白Pto由抗病基因P.s.pv.tomato编码,作为识别、防御病原菌的一种重要抗性蛋白,可以识别病原菌注入植物体内的效应蛋白,触发下游防御反应,在番茄的抗病机制中发挥重要作用[6-7]。在之前的研究中,通过使用酵母双杂交技术检测到与Pto互作的蛋白质,并命名为Pti (Pto interaction protein)[8-9]。其中Pti4/5/6编码蛋白质具有转录因子特性,可以特异结合于病程相关PR基因的启动子GCC box元件[10],被认为可能做为下游基因参与Pto所介导抗病途径。有研究表明,Pti4的表达可以由生物和非生物胁迫引起,受乙烯、水杨酸、创伤和病原菌诱导,而Pti5仅由病原微生物,如番茄斑点病致病菌丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000)诱导特异表达[11]。此外,还有报道认为Pti5通过上调PR基因使植物表现出对蚜虫的抗性[12]。已有报道均表明,Pti基因可能在番茄防御免疫、生长发育等多个过程中发挥作用,然而近年来对Pti基因的研究较少,对植物体内Pti的互作蛋白也所知甚少。因此,本文以正常生长番茄野生型叶片、接种丁香假单胞杆菌番茄致病菌株PstDC3000的感病株系prf3[13]、抗性株系PtoR[14]的叶片构建酵母双杂交cDNA文库,通过筛选文库Pti5互作蛋白信息,以利于后续对Pti作用机制的深入研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

本研究所用野生型番茄品种AC+、PtoR、prf3来自于美国康奈尔大学THOMPSON植物研究所,由本实验室繁育保存,种植于合肥工业大学食品与生物工程学院的人工气候培养室。

1.1.2 菌株与载体

丁香假单胞杆菌菌株PstDC3000,大肠杆菌E.coli菌株DH5α、KC8,酵母菌株EGY48,pEG202、pJG4-5载体。以上菌株和载体均由本实验室保存。

1.1.3 试剂与药品

质粒提取试剂盒、Oligotex mRNA Kit,均购于Qiagen;Trizol、反转录酶,均购于Invitrogen;DNA连接酶购于NEB;限制性内切酶、DNA聚合酶,均购于Takara;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、聚乙二醇3350 (PEG3350)、鲑鱼精DNA (carrier DNA),均购于Sigma-Aldrich;酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acid)、各种氨基酸,均购于生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖(glucose,Glu)、棉籽糖(raffinose,Raf)、半乳糖(galactose,Gal)、醋酸锂(LiAc)等均为国外原装进口或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 番茄叶片酵母双杂交cDNA文库的构建

分别取正常生长未处理野生型番茄植株叶片、以真空渗透法接种PstDC3000的感病株系prf3及抗性株系PtoR的叶片,液氮研磨提取总RNA。采用琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop 2000检测所提RNA的质量浓度和质量。使用Oligotex mRNA Kit试剂盒分离纯化mRNA,并按RNA质量浓度将不同处理条件的叶片样品等量混合,反转录合成cDNA用于文库构建。

参考Clontech公司提供的酵母双杂交文库构建方法,将合成的双链cDNA加5’接头,均一化处理后,利用同源重组法将已纯化的双链cDNA与酶切后pJG4-5载体连接,连接产物电转化大肠杆菌感受态细胞。

取转化菌液10 μL作为母液,稀释100倍后取出10 μL涂布于氨苄青霉素抗性的培养板。待单克隆长出后统计个数,用于计算文库容量,具体计算公式为：

文库容量=每皿平均克隆数/涂布体积×稀释倍数×转化体积。

挑取单克隆,依据载体特异引物(PJG4-5-F:CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG、PJG4-5-R:AAGCCGACAACCTTGATTGGAG)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,鉴定阳性率及插入片段大小。

1.2.2Pti5酵母双杂交载体的构建及转化

根据番茄Pti5基因(U89256)编码区序列设计引物SP5F(TCCCCGCGGATGGTTC CAACTCCTCAAAGT)、SP5R(CATGGGCCC TTAACATCTTGATTCAAATACATCATT),分别引入SacⅡ、ApaⅠ酶切位点。以番茄叶片cDNA为模板进行PCR扩增,将预期大小的条带经胶回收后连接于pEG202载体,转化大肠杆菌,涂布于固体培养基板,待单克隆长出后提取质粒,经酶切鉴定、测序,构建pEG202-Pti5钓饵(bait)载体。然后利用PEG/LiAc法将pEG202-Pti5载体转化EGY48酵母感受态,并进行PCR菌落鉴定,保存阳性转化酵母单克隆。

1.2.3 Pti5互作蛋白的筛选

以带有pEG202-Pti5质粒的酵母细胞制备感受态。将制备的酵母感受态细胞、carrier DNA与所构建文库的质粒混合、分装后,均匀涂布于三缺(-His/-Trp/-Ura)固体培养基,28 ℃培养至单克隆生长。将菌体用涂布棒刮下、收集,加等量甘油保存。取少量上述转化菌液进行培养,梯度稀释后分别涂布于四缺(-His/-Trp/-Ura/-Leu)固体培养基,待单克隆生长后转移至新的四缺固体培养基,再挑取酵母细胞单克隆至三缺固体培养基封闭,最后将酵母单克隆转至含X-gal的固体显色培养基,观察LacZ及Leu报告基因的表达情况,若出现蓝色克隆即为阳性克隆。将阳性克隆提取质粒,电转化E.coli菌株 KC8。菌落PCR鉴定为阳性克隆用于测序。将经测序获得的靶标基因序列在NCBI数据库进行Blast比对分析。

2 结果与分析

2.1 番茄叶片酵母双杂交cDNA文库分析

本文分别提取正常生长未处理的野生型番茄植株叶片、PstDC3000接种处理的感病株系prf3及抗性株系PtoR的叶片RNA,如图1所示。琼脂糖凝胶电泳显示,RNA条带清晰,核糖体条带清晰完整。RNA质量浓度均大于280 ng/μL,A260/A280为2.03～2.06,显示RNA质量良好,可用于mRNA分离和反转录。

图1 番茄叶片样品RNA

反转录双链cDNA加5’接头、均一化处理后连接pJG4-5载体,转化大肠杆菌感受态细胞。取10 μL转化菌液稀释100倍后取10 μL涂布于带有氨苄青霉素的培养板。培养皿平均生长克隆数为250个,计算文库容量为1.25×107CFU。随机挑取24个克隆,以载体特异性引物进行PCR扩增,电泳结果显示均有扩增产物,插入片段平均长度大于1 000 bp。结果表明,所构建番茄叶片酵母双杂交文库质量可用于后续筛选实验。

2.2 Pti5酵母双杂交载体构建结果分析

以番茄叶片cDNA为模板,经PCR扩增得到483 bp预期大小的产物,纯化后,经SacⅡ、ApaⅠ酶切、胶回收,连接于同样酶切的pEG202载体,并转化大肠杆菌。将转化单克隆提取质粒,进行酶切鉴定、测序,获得pEG202-Pti5钓饵载体,如图2所示。

图2 pEG202-Pti5载体酶切鉴定

将pEG202-Pti5载体转化酵母菌株感受态EGY48,对酵母单克隆进行PCR菌落鉴定。阳性酵母单克隆于X-gal显色培养基上划线28 ℃生长24 h。酵母克隆呈正常生长状态,表明Pti5的转入并未对酵母细胞产生毒性,也未显示自激活活性。

2.3 Pti5互作蛋白筛选结果分析

参照酵母双杂交文库筛选操作步骤,以pEG202-Pti5转化酵母细胞制备感受态,转入文库质粒,在培养板上可以看到大量共转化克隆生长,如图3a所示。

收集共转化克隆涂布至四缺固体培养基,再转移至三缺固体培养基,最后将酵母单克隆移至X-gal显色培养基,观察报告基因的表达情况。28 ℃培养24 h后发现有蓝色克隆出现,即为阳性克隆,如图3b所示。

图3 Pti5互作蛋白的筛选

挑取阳性克隆于液体培养基培养、抽提酵母质粒,然后将质粒电转化E.coli菌株 KC8,菌落PCR鉴定后,提取阳性克隆质粒用于PCR扩增,结果如图4所示。

根据阳性克隆插入片段大小及酶切情况,去除重复克隆。将阳性克隆质粒进行测序。测序比对结果显示,初步获得了3个可能的靶标互作基因:TCP transcription factor (NM-001246881)、serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538)和RNA-binding protein(XM-004242427)。

图4 阳性克隆PCR鉴定

3 讨 论

植物抗虫、抗病基因及其作用机制一直是植物功能基因研究及遗传改良的重要问题。番茄作为我国广泛栽培的一类果蔬类经济作物,其营养丰富,又是目前研究细菌性病害的一种常见模式植物[15]。

番茄细菌性斑点病是由丁香假单胞菌引起的病害,在世界范围内均有发病报道,病害发生后会降低番茄产量、影响其口味[16-17]。番茄抗病基因Pto最早通过图位克隆从抗病品种中获得[18],在番茄的抗病机制中发挥重要作用。Pti作为Pto的互作蛋白,与Pto的互作已经在植物表达系统中被验证[19],但对Pti基因的下游互作蛋白及其可能的作用机制仍缺乏深入了解。因此,本研究使用酵母双杂交技术进一步筛选与Pti5相互作用的蛋白质,以探讨Pti在番茄免疫防御中的作用途径。

通过选择不同组织、不同发育阶段以及不同条件处理的生物材料,提取RNA由反转录获得cDNA,形成特定条件下功能基因克隆的集合,用于构建高质量cDNA文库,是筛选互作蛋白的前提和保障[20-22]。本研究基于Pti基因在番茄抗病防御方面的功能,选取不同处理条件下、不同抗病、感病植株样品用于构建cDNA文库,以尽量使文库包含抗病途径中的相关基因。经检测该文库容量、插入片段大小及阳性率均符合文库要求,可用于Pti及其他抗病基因互作蛋白的筛选与后续机制研究。

本文在文库构建基础上进一步以Pti5为诱饵蛋白进行了互作蛋白筛选,初步获得了3个可能与Pti5互作的转录因子。Pti5是一个约20 kDa的小分子量蛋白,它很有可能通过与其他转录因子形成复合体而对目标基因进行转录调控。经过比对分析,靶标互作基因TCP transcription factor (NM-001246881)编码TCP转录因子,该转录因子家族为植物所特有,位于植物各种信号转导途径的枢纽[23],调控植物的生长发育及响应各种环境胁迫;serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538) 编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可能参与植物体响应胁迫信号[24];RNA-binding protein (XM-004242427)则编码RNA结合蛋白,该类蛋白在基因转录后表达调节中发挥功能,被认为介导植物对生长素、细胞分裂素等激素有一定的敏感性,并参与细胞内信号转导过程[25]。这些转录因子涉及植物生长发育、环境胁迫应答等调控途径,也与所推测Pti5在番茄中作用机制相吻合。这些筛选靶标蛋白是否在植物体内与Pti5相互作用,仍需要后续在植物表达系统中进一步验证。此外,由于Pti4/5/6基因具有功能机制的相似性,本文也为其他Pti基因作用机制的研究提供了基础。