扶正透邪方对耐药铜绿假单胞菌肺炎大鼠晚期炎症反应的影响

张迪 晏军 钱莹 姚兴伟 付跃峰 郭楠 刘清泉 孔令博

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是医院环境中最主要的病原菌，PA引起的院内肺炎占到院内肺炎病例的18%以上，最新研究显示，院内肺炎的死亡率已经到了13%～50%[1-2]。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种重要的晚期炎性介质，受到PA刺激后，单核巨噬细胞将其分泌到细胞外环境发挥促炎作用。HMGB1通过促进核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)核转位释放炎症细胞因子，如白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，炎症细胞因子进一步促进HMGB1的释放，形成一个正反馈回路，放大炎症级联反应[3-5]。耐药PA肺炎在感染途径、发病特点和病机上与中医学伏邪理论存在高度的一致性。扶正透邪方扶正以助透邪，透邪以助扶正，针对耐药PA肺炎有益气养血、透邪外出之功。前期研究证明扶正透邪方在早期可升高体内白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平，刺激促炎因子释放，帮助清除细菌和毒素[6]，但对后期的炎症反应研究不足。本实验通过观察扶正透邪方对耐药PA肺炎HMGB1水平的影响，及NF-κB和IL-6等相关细胞因子的表达，进一步探讨扶正透邪方对耐药PA肺炎的作用机制，为临床应用提供依据，同时丰富伏邪理论的科学内涵。

1 材料与方法

1.1 实验药物

扶正透邪方组成：黄芪60 g、当归15 g、金银花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，以上药物均为中药全成分免煎颗粒，由北京康仁堂药业有限公司提供。

1.2 实验菌株

耐药铜绿假单胞菌临床分离株，样本号：20PXSP1925，经北京中医药大学东直门医院细菌室进行菌种鉴定与药敏检测。

1.3 试剂与仪器

HMGB-1(批号：SEA399Ra)、IL-6 ELISA(批号：SEA079Ra)检测试剂盒，购自武汉云克隆科技股份有限公司；UltraPure Agarose(批号：16500100)、SuperScript III RT 逆转录kit(批号：11752050)、Sybr qpcr mix(批号：4472920)，均购自美国ABI-invitrogen；HMGB1抗体(批号：Ab79823)、NF-κB抗体(批号：Ab76311)，购自英国Abcam公司。酶标仪Microplate reader，ELx808，美国Biotek；荧光定量PCR仪，StepOne Software，美国Applied biosystems；SDS-PAGE电泳系统，Mini-PROTEAN®Tetra Cell with Mini Trans-Blot®Module And PowerPacTMUniversal Power Supply，美国BIO-Rad；凝胶成像系统，GelDoc-It310，美国UVP；ChemiDoc MP化学发光成像系统，170-8280，美国BIO-Rad。

1.4 实验动物及分组

清洁级SD大鼠12只，雄性，体重(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SYXK(京)2020-0013。购入后置于微生物免疫动物室动物洁净饲养。随机分为空白组、模型组和扶正透邪组，共3组。每组各4只，各组按于7天后留取标本。动物实验经北京盈科瑞生物医药研究所伦理委员会批准(批准号IACUC-YKRSW-2021-D001)。

1.5 模型制备、药物干预

1.5.1 模型制备 大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，待大鼠完全麻醉后，用皮筋将其固定于木板上，用镊子轻轻拉出大鼠舌头，打开照明灯对准大鼠颈部，调整大鼠头部位置，直到通过口腔可以看到声门裂。用微量进液器抽50 μL菌液，缓慢将微量进液器针头送入声门裂，向气管内缓慢滴注菌液。滴注菌液后迅速将大鼠从鼠板上取下，双手握住大鼠上肢，使大鼠直立，并左右摇摆，使菌液均匀分布于大鼠左右两肺[7]。空白组按上述方法在大鼠气管内注入等量的无菌生理盐水。造模过程中大鼠无死亡。

1.5.2 药物干预 空白组予蒸馏水灌胃；模型组在感染后予蒸馏水灌胃；扶正透邪组在感染后予扶正透邪全方水煎剂灌胃，各组灌胃每日2次，每次2 mL。扶正透邪方组成：黄芪60 g、当归15 g、金银花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，根据Meeh-Rubner计算实验动物的体表面积公式换算，每只大鼠使用药物为黄芪1.15 g、当归0.3 g、金银花0.3 g、青蒿0.2 g、虎杖0.2 g，相当于临床成人用量的0.019倍[8]。

1.6 检测指标及方法

样本制备：予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，麻醉后，常规消毒大鼠腹部皮肤，打开腹腔，分离腹主动脉，予一次性无菌采血针接5 mL空白采血管，进行取血，并留取肺组织。采血完毕后，空白采血管室温放置1小时，再4℃放置1小时，离心，2500 r/min，20分钟，分离血清，分装后-70℃保存。将肺组织切成小块，放入离心管中，置于-70℃保存。

1.6.1 病理切片 将肺组织制作石蜡切片，切片厚度4 μm，苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，显微镜下观察肺组织病理形态变化。

1.6.2 酶联免疫吸附测定 严格按照酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒说明书操作，检测血清中HMGB1、IL-6的OD450吸光度值，根据标准平浓度-吸光度值曲线折算出实际浓度。

1.6.3 逆转录聚合酶链式反应检测 取待检测样品，按照Trizol试剂盒说明书步骤提取总RNA，纯化后按照逆转录试剂盒SuperScript III说明书使其逆转录为cDNA，随后按照实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)体系进行引物扩增。扩增完毕后，使用2-ΔΔCt法计算HMGB1、NF-κB mRNA的相对表达量。

1.6.4 蛋白质印迹法(western blot，WB)检测 肺组织匀浆提取蛋白，稀释后测定蛋白浓度上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳完成后进行转膜处理。随后将膜在室温下封闭2小时，之后加入一抗抗体孵育1.5小时。一抗孵育完成后洗膜3次，再加入二抗抗体孵育2小时。最后将膜放至在显影仪中避光显影、拍照。

1.6.5 免疫组化检测 将各组肺组织，以HMGB1、NF-κB一抗和山羊抗兔的二抗进行常规免疫组化染色。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠HE结果

空白组支气管壁光滑完整，上皮细胞排列整齐，少量炎症细胞浸润；模型组气管壁充血水肿、管腔狭窄，肺泡腔缩小，大量炎症细胞浸润，上皮细胞排列紊乱、脱落；扶正透邪组管壁较模型组光滑，气管壁肿胀、管腔狭窄和炎症细胞浸润数量较模型组明显减轻。见图1。

注：A为空白组；B为模型组；C为扶正透邪组

2.2 各组大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比较

ELISA结果示：模型组外周血中HMGB1和IL-6的含量均明显高于空白组(P<0.05)，扶正透邪组外周血中HMGB1和IL-6的含量均明显低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比较

2.3 大鼠肺组织HMGB1和NF-κB的mRNA表达

模型组肺组织中HMGB1、NF-κB mRNA表达量明显高于空白组(P<0.05)，扶正透邪组HMGB1、NF-κB mRNA明显低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠肺组织HMGB1和NF-κB的mRNA表达

2.4 大鼠肺组织HMGB1和NF-κB的蛋白表达

模型组肺组织中HMGB1、NF-κB蛋白表达量明显高于空白组(P<0.05)，扶正透邪组HMGB1、NF-κB蛋白表达量明显低于模型组(P<0.05)。见表3、图2。

表3 大鼠肺组织HMGB1和NF-κB的蛋白表达

图2 大鼠肺组织HMGB1和NF-κB的蛋白表达

2.5 免疫组化

空白组HMGB1表达较弱，模型组HMGB1表达较强，扶正透邪组HMGB1表达较模型组减弱，深棕色为HMGB1表达阳性细胞，见图3。空白组NF-κB表达较弱，模型组NF-κB表达较强，扶正透邪组NF-κB表达较模型组减弱，深棕色为NF-κB表达阳性细胞，见图4。

注：A为空白组；B为模型组；C为扶正透邪组(深棕色为HMGB1表达阳性细胞)

注：A为空白组；B为模型组；C为扶正透邪组(深棕色为NF-κB表达阳性细胞)

3 讨论

伏邪是指感受邪气，即时不发，伏藏于体内，逾时而发。研究伏邪理论发现耐药菌感染在感染途径、发病特点和病机上存在高度一致性[9]。伏邪的祛除强调“透邪”，透邪主要有两层含义：一是要用透的方法给邪以出路，透达邪气[10]；二是祛邪要除透、除尽，避免未除之邪继续伏留体内，耗伤正气。在伏邪的治疗上，扶正亦是关键。抗生素多属寒凉，加之伏邪发病多有发热，苦寒之药的使用，都会损伤人体阳气，因此在治疗上温阳助阳就显得尤为重要。正如柳宝诒的《惜余医案》所说：“若惟取其阴而不鼓动其阴中之阳,恐邪机仍冰伏不出。拟于大剂养阴托邪之中,佐以鼓荡阳气之意,俾邪机得以外达三阳为吉[11]。”因此伏邪的治疗以扶正透邪为主，扶正以助透邪，透邪以助扶正。刘清泉教授经过几十年临床实践和对伏邪理论的深入研究，博采众方，提出以扶正透邪方治疗耐药铜绿假单胞菌肺部感染，为临床耐药菌感染治疗拓宽了思路[12]。方中以黄芪、当归、金银花为主药，黄芪健脾补中，升阳举陷，其扶正助气功效可使邪热外透、托毒外达，因此剂量最大；金银花散热解毒，善于透血分热邪于外转入气分；当归补血活血，兼能行血；青蒿清透虚热、凉血除蒸，可治疗病邪在气分、血分之病，虎杖清热化瘀。大剂量黄芪与当归相配，如《内伤外辨惑论》的当归补血汤，是经典的气血双补之方，方中重在黄芪大补肺脾以资气血生化之源，配以当归以补气生血，令血气充盈，阴平阳秘，可针对热病日久，耗气及血而致气虚血亏、气滞血瘀之证，并可退虚热；黄芪与金银花相配为外科疮疡方中常用配伍，意在益气和营清热，两药相配性甘味稍凉，即免苦寒耗损气阴，又可透邪外出。当归、金银花取自四妙勇安汤，有通利血脉、活血补血、透邪外出之意。全方补而不腻，给邪以出路，从而达到益气养血，透邪外出之功。

耐药铜绿假单胞菌感染引起的炎症反应分为早期和晚期，早期反应以促炎为主，主要促炎因子有TNF-α、IL-1β等。研究发现，扶正透邪方在早期可升高体内IL-1β水平，刺激促炎因子释放，帮助清除细菌和毒素[6]。但对晚期炎症因子的研究较少，晚期如果炎症得不到控制，启动炎症信号级联传递，会导致病情加重，死亡率升高。HMGB1是一种高度保守的非组蛋白染色体蛋白，在细胞内、外微环境中起着不同的作用，是典型的炎性反应晚期调节因子[13]。研究发现，PA感染的COPD患者HMGB1呈高表达水平，且随感染加重肺功能损伤进一步加重，血清中HMGB1水平也随之增高[14]。升高的HMGB1可以和PA的膜成份LPS结合，同时作为转移分子将二者复合物带到CD14和TLR4，作用于TLR4下游信号通路，导致NF-κB激活，促进TNF-α、IL-1β等炎症基因转录，引起炎症反应[15- 16]。丁军颖等[17]观察PA肺炎大鼠免疫功能时发现PA肺炎大鼠HMGB1及效应分子IL-1β、TNF-α均明显升高，对PA感染大鼠使用HMGB1拮抗剂可明显减少TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放[18]。HMGB1还可损害巨噬细胞的吞噬能力，增加感染PA小鼠的死亡率，GTS-21可以抑制HMGB1释放从而增强巨噬细胞的功能，提高细菌清除率，减少肺损伤[19]。以上研究表明HMGB1在PA肺炎中发挥重要作用。本研究发现，与空白组比较，模型组HMGB1基因和蛋白表达水平均升高，同时伴有肺组织损伤，与以上结果相一致。在此基础上，扶正透邪方可降低HMGB1基因和蛋白的表达，改善肺组织损伤情况，说明扶正透邪方可减轻PA感染晚期炎症反应，保护肺组织。

NF-κB是目前研究最多的炎症相关通路之一，NF-κB信号通路活化与机体炎症因子分泌密切相关。研究表明，给予肺上皮细胞铜绿假单胞菌LPS处理后，可以明显活化NF-κB信号通路，表明NF-κB是引起机体炎症反应的重要原因[20]。HMGB1分泌到细胞外环境中后可结合多种受体激活NF-κB信号通路，如HMGB1与RAGE结合后，引发Ras、PI3K和Rho的激活，并成为下游NF-κB激活的主要信号分子[21]。HMGB1也可与TLR4结合，激活NF-κB，引起下游的炎症介质释放[22-23]。HMGB1也可与TLR9相互作用，通过与TLR9结合引导MyD88和NF-κB的下游途径发出信号，促进细胞因子的释放[24]。因此，HMGB1可以通过与多种受体结合激活NF-κB，进而转录促炎基因，如IL-1、IL-6和TNF-α等，发挥促炎作用[25]。IL-6在感染性病变中产生，并向全身发出警告信号。HMGB1被PRR识别后刺激包括NF-kB在内的一系列信号通路，并增强IL-6等炎性细胞因子mRNA的转录[26]。使用HMGB1抑制剂甘草酸，或使用HMGB1小干扰RNA(siRNA)可以有效地抑制HMGB1介导的TLR4/NF-kB途径[27-30]。虽然关于PA肺炎与HMGB1的研究很少，但在PA感染角膜炎的小鼠中使用siRNA沉默HMGB1后，可以降低NF-κB及下游炎症因子的表达[31]，说明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是PA肺炎后期炎症反应的重要通路。本研究发现，与空白组相比较，模型组HMGB1、NF-κB的基因和蛋白表达量均升高，同时IL-6水平也升高，说明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是大鼠晚期炎症反应的通路之一。扶正透邪方可以降低PA肺炎大鼠HMGB1、NF-κB基因和蛋白表达，同时降低IL-6水平，在炎症的晚期发挥作用。

本研究从动物实验出发，探讨了扶正透邪方对耐药PA肺炎大鼠晚期炎症反应的影响，表明扶正透邪方可以减少PA肺炎晚期炎症因子的释放，保护肺组织。由于HMGB1的受体较多，因此对于HMGB1作用于NF-κB及NF-κB后续调控IL-6释放等过程研究不足，有待进一步的研究。

综上所述，扶正透邪方可以减少HMGB1释放来抑制NF-κB的核转位，进而抑制IL-6的释放，可能通过HMGB1/NF-κB/IL-6通路起到控制晚期炎症反应水平，保护肺组织的作用。提示扶正透邪方可以有效调节机体的晚期炎性免疫应答，进一步阐释了扶正透邪方作用机制，丰富了伏邪理论，但具体反馈调节机制有待进一步的研究揭示。