分光光度法测定食品中亚硝酸盐含量标准曲线 线性范围的研究

魏文强

（通渭县食品药品检验检测中心，甘肃通渭 743300）

亚硝酸盐是一种广泛使用的食品添加剂，是我国允许使用的食品添加剂之一。常用于乳制品、肉类、腌渍蔬菜等食品加工行业，剩菜剩饭、久置的蔬菜和白开水中也会产生亚硝酸盐。亚硝酸盐具有良好的防腐抗氧化、发色及抑菌等作用，能延长食品的保质期，使食物颜色更鲜艳、味道更鲜美，但亚硝酸盐存在一定的毒性，若过量使用会严重影响人们的身体健康。亚硝酸盐进入人体血液后，会使血红蛋白变性，血液的携氧能力降低，造成人体缺氧症状，影响人的生命健康[1]。亚硝酸盐在人体内很容易与蛋白质分解产物在酸性条件下反应转换成亚硝胺，而亚硝胺是一种强致癌物质，大量或长时间摄入能够诱发肿瘤的产生，所以必须对食品中的亚硝酸盐含量进行控制和定量检测[2]。

1 分光光度法测定亚硝酸盐标准曲线制作存在的问题

目前，我国检测食品中亚硝酸盐的方法依据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016），检测方法有离子色谱法和分光光度法[3]。分光光度法具有简单、快速、灵明度高、经济等优点，被各检测实验室广泛使用，但在实际的检测工作发现分光光度法在标准曲线存在以下两个方面的问题。

1.1 标准曲线线性范围较窄，高含量食品无法直接测定

根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定腌腊肉制品类、肉灌肠类、酱卤肉制品类等食品残留量以亚硝酸钠计，残留量≤30 mg/kg，西式火腿（熏烤、烟熏、蒸煮火腿）类、肉罐头类等食品残留量以亚硝酸钠计，残留量≤70 mg/kg[4]。按照标准曲线系列浓度里最高点12.5 μg进行计算，取样品西式火腿5.000 g，代入亚硝酸含量计算公式进行计算，得出该标准曲线的最高点的亚硝酸钠含量为12.5 mg/kg，因此当西式火腿、肉罐头等样品中的亚硝酸盐含量大于12.5 mg/kg时，按照分光光度法测定，样品的吸光度值一定大于标准曲线的最高点的吸光度值，超出了标准曲线的范围，所测定值误差较大，不能使用。对亚硝酸钠含量低于12.5 mg/kg检测样品可以直接进行测定，但对于亚硝酸含量大于12.5 mg/kg检测样品需要进行稀释后，才能进行测定，当大批量进行样品检测时，给检测工作带来了额外的工作负担，造成了试剂的浪费和人力的消耗，同时也会因样品进行二次稀释造成最终结果不准确，导致误差变大[5]。

1.2 标准曲线各点的吸光度值偏低，不在最佳范围内

吸光度值过大过小都会造成测量误差。吸光值过小，造成仪器信噪比下降，使分析误差增大。吸光值过大，会因为杂散光的影响，造成分析结果偏大或偏小，使分析误差变大。由朗博-比尔定律可知，当普通的分光光度计吸光度值为0.434 3时，吸光度的测量误差最小。使用分光光度法测定样品时，吸光度读数最佳范围应为0.2～0.8，同时所测定的样品吸光度值要低于标准系列中的最大吸光度值[6]。采用分光光度计对亚硝酸盐标准系列最高点12.5 μg的吸光度值进行了反复多次测定，得出的最高吸光度值为0.253 5，标准系列共9个点，其余各标准系列点的吸光度值均小于0.2，表明亚硝酸盐的标准曲线不在最佳的线性范围内，得到标准曲线可能不符合质控要求，造成最终的测量结果误差较大。

为了解决以上存在的两个问题，提高工作效率，尽量减少实验误差，保证检测结果的准确性，在《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法线性范围的基础上对标准曲线的点进行适当的扩展。

2 材料与方法

2.1 实验试剂

亚硝酸钠标准溶液（200 μg/mL）、四硼酸钠（分析纯）、对氨基苯磺酸（分析纯）、盐酸萘乙二胺（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、蒸馏水。

2.2 仪器与设备

紫外分光光度计（UV8000s）：上海元析仪器有限公司；电子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg）：德国赛多利斯科学仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

2.3 实验方法

2.3.1 改进方法一标准曲线的绘制

取9支50 mL具塞比色管，保持标准中亚硝酸钠标准使用液的浓度（5 μg/mL）不变，仅改变亚硝酸钠标准使用液的吸取量，分别加入0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、 2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL（相当于0.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg、12.5 μg、15.0 μg、20.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分别加入2 mL的4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L盐酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混匀，制得标准系列溶液，室温下显色15 min后，以零号管为空白参比，在538 nm波长下测定吸光度。

2.3.2 改进方法二标准曲线的绘制

取9支50 mL具塞比色管，改变标准中亚硝酸钠标准使用液的浓度，从5 μg/mL改变成20 μg/mL，保持亚硝酸钠标准使用液的吸取量不变，分别加入0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、 0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL（相当于0.0 μg、4.0 μg、8.0 μg、12.0 μg、16.0 μg、20.0 μg、24.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分别加入2 mL的4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L盐酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混匀，制得标准系列溶液，室温下显色15 min后，以零号管为空白参比，在538 nm波长下测定吸光度。

3 结果与分析

3.1 两种改进方法的标准曲线的比较

由表1和图1可知，改进方法一的标准曲线方程为y=0.020 8x＋0.000 2，改进方法二的标准曲线方程为y=0.021 1x-0.000 4，两条曲线的相关系数都在0.999以上，各项均符合要求，能满足测定要求，图1中标准曲线一斜率与标准曲线二斜率几乎一致因此被覆盖。

表1 两种改进方法测得标准系列吸光度值的比较

图1 改进标准曲线对比图

3.2 实验验证

将已知浓度的标准样品进行吸光度值测定，然后分别带入标准曲线一、二计算。由表2可知，标准曲线一、二得到的标准样品浓度均在理论值范围内。

表2 亚硝酸盐标准样品比对实验测试结果（单位：μg）

4 结论

在《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法的基础上对标准曲线的点进行适当地扩展，标准曲线主体部分的吸光度值在0.2～0.8。亚硝酸盐含量较高的待测样品的吸光度值涵盖在标准曲线范围内，能够满足亚硝酸盐含量较高的食品检测，不需要对样品进一步稀释，这两种改进方法扩大了亚硝酸盐的检测范围，具有操作简单、灵敏度高、结果准确的特点，可以代替原有的标准曲线，且不影响实验结果，能够满足日常的检验要求，值得在实际检测工作中推广。