脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异

王乃利，孟 姝，仇文颖，王 霞

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 1.人体解剖与组织胚胎学系；2.免疫学系，北京 100005)

动静脉畸形(arteriovenous malformation，AVM)是一类动静脉血管间异常连接的罕见血管疾病，易破裂出血，是患者致残的重要风险因素。常发生于中枢神经系统，包括脑动静脉畸形(brain AVM，bAVM)和脊髓动静脉畸形(spinal AVM，sAVM)[1]。

对AVM发病机制的研究多集中于bAVM， 如血管形成异常，包括血管生成抑制基因 miR-137和miR-195*表达降低[2]、Sox2(transcription factor SOX-2，转录因子SOX-2)-JMJD5(bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5，双功能肽酶和精氨酸羟化酶)作用引起内皮细胞间充质转化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)[3]，细胞间通讯异常[4]。在sAVM发现细胞外基质和血管形成相关蛋白质表达量异常[5]。

此外，在bAVM和sAVM中均发现内皮祖细胞的富集[6]、及KRAS(GTPase KRas，GTP酶)/BRAF(serine/threonine-protein kinase B-raf，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)突变[1]诱导的内皮细胞MAPK-ERK(mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)通路激活[7]。尚无报道两种疾病间的分子表达特异性。对比bAVM和sAVM的蛋白质表达差异，对深入研究bAVM和sAVM的分子机制，开发疾病特异性的诊断或治疗方法具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料: 患者bAVM标本(4例)和sAVM标本(4例)来自于清华长庚医院，对照组脑血管(4例)和脊髓血管(4例)来自于国家发育和功能人脑组织库，对照组捐献者无神经系统和血管系统相关疾病。标本详细信息参见表1。所有标本于-80 ℃保存。本研究已获得中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会审核(伦理批准号：2018008)。经患者知情同意。

表1 入组患者基本信息Tabel 1 Patient’s information

1.1.2 试剂:尿素(urea)、二硫苏糖醇和碘乙酰胺来自于GE Healthcare公司；蛋白酶抑制剂cocktail来自于Roche公司；Tandem Mass TagTM(TMT)试剂、PBS、甲酸、乙腈、蛋白marker(Thermo Scientific公司)；Trypsin/Lys-C(Promega公司)；三乙基碳酸氢铵溶液、羟胺、考马斯亮蓝染液(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 组织蛋白的提取:在冷PBS中去除组织中血污染，去除bAVM标本中黏连的脑组织。标本在液氮中迅速冷冻并研磨成粉，加入冷组织裂解液(8 mol/L urea的PBS溶液，含蛋白酶抑制剂cocktail)，4 ℃裂解40 min，12 000×g离心10 min取上清即为组织蛋白提取液。使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定蛋白质浓度。

1.2.2 蛋白质的还原、烷基化和TMT标记: 组内按等质量混合各样本蛋白质，制备混合蛋白液。每组取100 μg上述蛋白液，加入10 mmol/L二硫苏糖醇，37 ℃反应1 h，然后加入25 mmol/L 碘乙酰胺，室温反应1 h。加入Trypsin/Lys-C 37 ℃反应过夜，将蛋白酶解成肽段。脱盐后，0.2 mol/L三乙基碳酸氢铵溶液溶解肽段，各组加入0.8 mg TMT试剂室温标记1 h：TMT-126标记bAVM，TMT-128标记对照脑血管，TMT-129标记sAVM，TMT-131标记对照脊髓血管。加入羟胺中和游离的TMT分子，混合各组样品后脱盐。

1.2.3 高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分级和液相色谱质谱联用(liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS/MS)的检测:为了提高质谱检测到的蛋白质数量，使用HPLC对肽段进行分组。简要步骤为：多肽溶解于100 μL 1%甲酸溶液中，注入HPLC分离。分离色谱柱为Xbridge BEH300 C18 柱子(4.6 mm×250 mm，Waters)，柱温维持45 ℃；流动相为乙腈和水(pH=10)，流速为1 mL/min；紫外吸收波长设为214 nm。每1.5 mL收集为1管，最终合并为12组分，旋蒸去除所有溶剂。

将上述12组分分别溶解于20 μL 1%甲酸溶液中，进行LC-MS/MS (Thermo Q Exactive质谱仪)检测。梯度洗脱条件：C18分析色谱柱(300 Å，75 μm×150 mm)，0.30 μL/min，120 min。质谱检测条件：Q Exactive质谱采取数据依赖性采集模式，Orbitrap(400-1 800 m/z，60 000分辨率)中行全谱扫描，随后以27%碰撞能量(higher-energy C-trap dissociation，HCD)进行10次数据依赖的MS/MS扫描。

质谱获得的数据使用Proteome Discoverer 2.2软件进行搜库，人源fasta数据库于2020年10月在Uniprot网站下载。

1.2.4 生物信息学分析:可信蛋白质的筛选条件设置为：unique peptide≥2，FDR≤0.01，差异蛋白质的筛选条件设置为：变化倍数≥2.0或≤0.5。蛋白质组数据分析使用到多个分析平台和软件：悟空云平台(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)进行PCA、HCA、相关性分析，Funrich软件进行Gene Ontology分析，Cytoscape软件进行ClueGO和蛋白质-蛋白质相互作用分析，网络版WEB-based GEne SeT Analysis Toolkit进行Wikipathway分析，GraphPad Prism辅助作图。

1.2.5 蛋白质表达水平的验证:通过Western blot验证蛋白质在bAVM、sAVM、对照脑血管和对照脊髓血管中的表达水平。由于蛋白质总量有限，将各组的样本按照等质量混合。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度后，将各组蛋白质进行SDS-PAGE分离，通过考马斯亮蓝染色确定各组上样量。将等质量蛋白通过SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭后，使用1∶1 000稀释的一抗(MMP9，ab137867，Abcam；VDAC，cst-4866，Cell Signaling Technology公司)在4 ℃ 孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，化学发光法检测抗原抗体结合条带。

2 结果

2.1 高通量质谱检测bAVM和sAVM中蛋白质表达谱的异同

在对照脑血管、bAVM血管、对照脊髓血管、sAVM血管中共检测到3 102个高可信度蛋白质。对照组脑血管和脊髓血管的蛋白质表达谱相近，相关性系数为0.98，bAVM畸形血管中蛋白质的表达丰度与其他3组的差异最大(图1)。

A.PCA analysis；B.HCA analysis；C.correlation analysis图1 对照脑血管和脊髓血管的蛋白质表达谱相近Fig 1 Similar protein profiling in control cerebral vessels and spinal vessels

bAVM畸形血管中蛋白质表达量发生变化的蛋白质数量更多(图2A)。相比于对照组血管，bAVM畸形血管中286个蛋白质的表达量下调，566个蛋白质的表达量上调；sAVM畸形血管中90个蛋白质的表达量下调，115个蛋白质的表达量上调。bAVM和sAVM中表达量变化的蛋白质共941个，其中116个蛋白质在两种畸形血管中的表达量均显著改变(图2B)。在本研究中，将这941个蛋白质定义为全部差异表达蛋白质。

941个差异表达蛋白质的HCA分析结果显示(图2C)，这些蛋白质可分为12个cluster，其中cluster 4中304个蛋白质仅在bAVM血管中显著高表达，cluster 5中97个蛋白质仅在sAVM血管中显著高表达。后续对cluster 4和cluster 5中的蛋白质分别进行分析。

A.satter plot displayed protein expression alterations in bAVM and sAVM；B.venn map showed that a total of 941 DEPs were detected,among which 116 proteins were found in both groups；C.HCA analysis of 941 DEPs,proteins in cluster 4 were specially upregulated in bAVM,and proteins in cluster 5 were specially upregulated in sAVM

2.2 bAVM畸形血管细胞中线粒体稳态及钙调节失衡

在bAVM中显著高表达的304个差异表达蛋白质主要为线粒体及相关蛋白质，富集于线粒体复合物I、电子传递链、钙调节等信号通路(图3)。

FDR.false discovery rate; A.gene ontology analysis; B.wikipathway analysis of 304 proteins in cluster 4图3 bAVM畸形血管中线粒体稳态及钙调节失衡Fig 3 Mitochondria dysfunction and calcium dysregulation in bAVM

2.3 sAVM中细胞外基质蛋白质及其糖基化异常

sAVM畸形血管中显著高表达的97个蛋白质(cluster 5)主要是以ADAM10(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、MMRN1(multimerin-1)、TNC(tenascin)、VCAN(versican core protein)、KNG1(kininogen-1)、LAMB1(laminin subunit beta-1)为核心的细胞外基质蛋白或糖蛋白(图4)。

A.gene ontology; B.protein-protein interaction analysis of 97 proteins in cluster 5图4 sAVM中细胞外基质蛋白质及其糖基化异常Fig 4 Alteration of extracellular matrix organization and proteoglycans in sAVM

2.4 Western blot检测bAVM和sAVM中蛋白质表达水平

线粒体蛋白VDAC(voltage-dependent anion channel)在bAVM中显著高表达，细胞外基质蛋白MMP9(matrix metalloproteinase-9)在sAVM中显著高表达(图5)。

A.coomassius blue staining；B.Western blot analysis图5 Western blot检测VDAC和MMP9在bAVM和sAVM中的表达水平Fig 5 Western blot verification of VDAC and MMP9 in bAVM and sAVM

3 讨论

蛋白质组学技术以蛋白质组为研究对象，可无偏见的、在整体水平探究细胞或组织的蛋白质组成及其动态变化规律。探究bAVM和sAVM的蛋白质组表达，可系统地评估两种疾病的相似和差异，为寻找疾病的特异性分子机制或靶标提供线索。

前期蛋白质组学研究报道，参与细胞间通讯的分子黏附通路蛋白质的表达水平在人bAVM和sAVM畸形血管中均显著改变[4-5]。本文中，作者发现线粒体稳态及钙调节相关蛋白质的表达水平在bAVM中明显改变，细胞外基质蛋白质在sAVM中显著高表达。该结果揭示了bAVM和sAVM特异性的分子特征，为充分理解bAVM和sAVM的分子机制提供参考和补充。

线粒体和内质网是细胞内重要的钙离子储存器，VDAC是线粒体外膜上高表达的钙转运蛋白，通过Grp75(glucose related protein 75)偶联IP3Rs形成大分子转运体，介导线粒体外膜将钙离子从内质网转运至线粒体内[8]。钙离子可直接激活电子传递链和ATP合酶的活性，促进ATP生成[9]，调控线粒体能量代谢。在心肌细胞中，抑制线粒体复合物I可引起线粒体能量异常，导致细胞死亡[10]。本文结果显示bAVM中多个线粒体复合物I蛋白的表达水平显著升高，推测线粒体稳态及钙调节失衡在bAVM的病理过程中可能具有重要调节作用。

细胞外基质是存在于细胞间的动态网状结构，由胶原、蛋白聚糖、弹性纤维等大分子物质组成。通过与细胞表面上的受体结合，调控细胞骨架结构，引起细胞内细胞传导，影响细胞的增殖和分化。基质金属蛋白酶ADAM10-Notch通路、细胞外基质糖蛋白TNC-RhoA/ROCK通路可影响内皮细胞间紧密连接参与血管结构稳态调节[11-13]。细胞外基质黏附蛋白MMRN1结合内皮细胞 vWF(von Willebrand factor)，稳定血小板黏附[14]。通过ADAMTS5水解VCAN成为versikines，促进血管内皮细胞的黏附、增殖，促进新生血管形成[15]。在本研究中，作者发现以ADAM10、TNC、VCAN、MMRN1为核心的细胞外基质蛋白及糖蛋白的表达水平在sAVM中过表达，在bAVM中的变化差异无统计学意义。提示细胞外基质组成对sAVM血管结构的稳定具有重要调控作用。

本文仍存在一定的局限性：本文结论是基于小样本量蛋白质组学分析的推测，需在大数量样本上进行验证，并在细胞水平进一步证实该结论。