mRNA甲基化与疾病的研究进展

李 冉，郝延磊

(1.山东大学 齐鲁医学院，山东 济南 250100； 2.济宁医学院附属医院 神经内科， 山东 济宁 272000)

信使RNA (messenger RNA, mRNA)是由DNA转录合成的一类具有遗传信息的RNA，在蛋白质合成中起模板作用，并决定肽链的氨基酸序列，是人体中一类重要的RNA。甲基化是指将一个甲基基团从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸, S-adenosylmethionine, SAM)催化转移到另一种化合物的过程，这个过程通过化学修饰某些蛋白质或核酸，从而形成甲基化产物。在20世纪70年代初，科学家发现甲基化修饰(N6-甲基腺苷, N6-methyladenosine, m6A)存在于mRNA上，从而证明了甲基化的存在[1]。mRNA甲基化类型很多，目前最热门的有3种，分别是：m6A甲基化﹑N5-甲基胞苷(N5-methylcytidine, m5C)甲基化和N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)甲基化。mRNA甲基化参与调控多种生物学过程，其水平的异常也会导致许多临床疾病发生。本文分别从mRNA甲基化的发现与分布情况、甲基化修饰相关酶与结合蛋白“编码器”“消码器”“读码器”三个参与者、与临床疾病的联系以及甲基化检测技术进行简要综述。

1 甲基化的发现与分布情况

1974年发现肝癌细胞中mRNA的甲基化状态，其中约80%为m6A。mRNA甲基化还包括m5C、m1A、N7-甲基鸟苷(N7-methylguanosine, m7G)、2’O-甲基化(2’O-methylation, Nm)、N6,2’O-二甲基腺苷(N6,2’O-dimethyladenosine, m6Am)、5-羟甲基胞苷(5-hydroxymethylcytosine, hm5C)等[1]。

借助高通量测序技术，初步获得一个甲基化分布图谱(图1)。其中，m6A是mRNA中最常见和最丰富的甲基化，可影响多种生物学过程，平均每个转录本有1～3个m6A。m6A mRNA甲基化主要位于RRACH序列中腺嘌呤的氮原子上，约94.8%分布于基因内部，其中蛋白编码区(sequence coding for aminoacids in protein, CDS)、非编码区(untranslated region, UTR)和内含子的比例分别为50.9%、41.9%和2.0%。UTR区的m6A倾向于富集在3′UTR中，而CDS区的m6A主要富集在终止密码子附近[2]。

正常情况下，m5C甲基化在真核生物转运RNA (tRNA)和核糖体RNA (rRNA)中高丰度稳定存在，而在mRNA中含量较少；在哺乳动物的mRNA分布上十分保守，主要富集在CG区，不同组织中修饰的基因具有特异性，可调节细胞周期、促进蛋白质翻译和分化等[3]。m1A甲基化在tRNA和rRNA中丰度也很高，近期发现也广泛存在于真核生物各种细胞系的mRNA中；大多数m1A富集在mRNA的5′UTR区，尤其是转录本第一和第二位上的m1A可促进mRNA翻译，明显增强基因向蛋白质的表达过程，与蛋白质的产生呈正相关，而位于编码区的m1A则抑制翻译[4]。Nm甲基化在mRNA、tRNA、rRNA等上均有分布，普遍存在于哺乳动物、酵母、植物、病毒中，在人的mRNA中发现了数千个Nm位点；通过提高核苷酸的疏水性，从而增强其稳定性，影响mRNA与蛋白的结合、调控翻译效率等生物过程[5]。此外，m7G甲基化也存在于各类分子中，包括mRNA 5′帽子结构与内部、tRNA和rRNA等，调节mRNA的输出、翻译和剪切等生物学过程[6]。

延伸帽结构经甲基化修饰后，除了富集m7G外还具有不寻常的5′-三磷酸键。若第一个核苷酸是腺苷(adenosine, A)且携带了Nm，进而可修饰成双甲基化核苷酸：m6Am，仅存在于延伸帽中。此外，还在mRNA中发现了N4-乙酰胞苷(N4-acetylcytosine, ac4C)，富集于CDS起始处；它是由N-乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)催化的一种保守mRNA甲基化修饰，可通过改善mRNA的稳定性和翻译来促进靶基因的表达[7]。不同甲基化的化学结构式见图2。

颜色表示不同甲基化，圆圈大小表示富集程度图1 不同甲基化在mRNA中分布情况Fig 1 Distribution of different methylation modifications in mRNA

图2 不同甲基化的化学结构式Fig 2 Chemical structural formula of different methylation modifications

2 甲基化修饰相关酶与蛋白

甲基化修饰是一种动态可逆的过程(图3)，对mRNA的影响通常需要以下三者的参与：“编码器”(writers)是指甲基转移酶，甲基化是由一个多亚单位以高度特异性的方式添加到mRNA上的；而“消码器”(erasers)则是指可以逆转甲基化过程的去甲基化酶；甲基化修饰后的mRNA具有特定的生物学功能，需要特定的RNA结合蛋白，即“读码器”(readers)[2]。

图3 甲基化动态可逆过程Fig 3 Dynamic reversible process of methylation

m5C甲基化可调控mRNA出核，NSUN2蛋白是m5C mRNA主要的甲基转移酶，NSUN2缺失可导致mRNA的出核受到抑制；RNA结合蛋白ALYREF特异性结合m5C修饰位点，从而促进mRNA出核；而敲除m5C mRNA另一个甲基转移酶TRM4B，可导致mRNA上m5C水平减少并降低稳定性[3]。甲基转移酶TRMT6/61A参与m1A甲基化，m1A mRNA优先被募集到多核糖体以促进翻译伸长；ALKBH1、ALKBH3作为m1A mRNA去甲基化酶，能够催化m1A mRNA去甲基化，从而调控翻译[4]。METTL1则是m7G mRNA的甲基化转移酶[6]。由于m6A甲基化占全部mRNA甲基化的80%以上，以下对m6A甲基化的“编码器”“消码器”和“读码器”进行详细介绍。

2.1 m6A“编码器”

是指m6A甲基转移酶，一组重要的催化酶。甲基转移酶3/14 (methyltransferase like 3/14, METTL3/14)、Wilms肿瘤结合蛋白1 (Wilms′ tumor 1-associating protein, WTAP)、VIRMA (Vir like m6A methyltransferase associated)、Cbl原癌基因1 (Cbl proto-oncogene like 1, CBLL1)、锌指CCCH域蛋白13 (zinc finger CCCH-type containing 13, ZC3H13)和RNA结合基序蛋白15/15B (RNA binding motif protein 15/15B, RBM15/15B)等形成m6A“编码器”复合物共同发挥催化作用[2]。

METTL3和METTL14以1∶1的化学计量比形成一个稳定的复合物，复合物的甲基化活性高于单独的METTL3。METTL3具有催化能力，最早被发现可以结合SAM，在真核生物中高度保守。而METTL14虽与METTL3同源，但在催化上并不活跃，不与SAM结合，不具有独立的m6A甲基转移酶功能，是复合物中的一个惰性物质；但包含RNA结合位点，可稳定METTL3，还是METTL3酶活性的变构激活剂。但近期发现一些m6A位点是由METTL14形成的，纯化的METTL14具有独立于METTL3的m6A合成能力[8]。

WTAP是m6A“编码器”的调节亚基，可与METTL3-METTL14复合物相互作用，将“编码器”锚定在染色质上，对m6A的形成至关重要；敲除后可导致METTL3-METTL14的核散斑体定位丢失，能显著降低细胞mRNA中m6A峰值，甚至比直接敲除METTL3或METTL14更明显[8]。VIRMA最初称为KIAA1429，与WTAP、METTL14一样是甲基化所必需的，其N端具有募集甲基转移酶中METTL3、METTL14、WTAP的能力，继而能实现对mRNA上m6A水平的定点调控；敲除后可导致哺乳动物细胞中m6A的大量丢失[9]。

RBM15/15B这2种同源RNA结合蛋白都含有RNA结合结构域，可促进编码器在mRNA中特定位点的聚集。单独敲除RBM15或RBM15B可降低细胞mRNA中的m6A水平，同时敲除二者可使m6A水平显著降低[10]。CBLL1又称HAKAI，是一种E3泛素连接酶，参与m6A mRNA甲基化，敲除后可导致m6A水平的降低。ZC3H13是将WTAP-VIRMA-HAKAI复合物固定在细胞核中的关键，敲除后可导致m6A水平的降低[11]。

2.2 m6A“消码器”

是将m6A转化为A的去甲基化酶。在人子宫颈癌(HeLa)细胞系的生命周期中，mRNA中的m6A水平是稳定的；m6A“消码器”似乎仅限于特定组织，如睾丸，或在特定的应激和疾病相关条件下[12]。在真核生物中，它包括脂肪与肥胖相关基因蛋白(fat mass and obesity associated, FTO)和Alk B同源蛋白5(Alk B homologue 5, ALKBH5)。

FTO是Alk B家族的一员，也被称为Alk B同源蛋白9 (ALKBH9)，与肥胖相关，是最早被发现的m6A mRNA去甲基化酶，可影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力，进而调控mRNA前体的剪切加工过程；但最新发现，FTO优先去甲基化m6Am而非m6A，降低了m6Am mRNA的稳定性[13]。而ALKBH5是Alk B家族的另一种去甲基化酶，在N端有一个富含丙氨酸的区域和一个独特的螺旋折叠结构；它不同于FTO的氧化去甲基化，可直接催化m6A mRNA去甲基化；ALKBH5的去甲基化活性显著影响mRNA的输出和剪切等生物学过程，缺乏或过表达分别导致细胞m6A水平的增加或减少，其基因敲除可使雄性小鼠减数分裂中期精母细胞凋亡导致生育能力受损[14]。

2.3 m6A“读码器”

包括含有YTH (YT521-B homology)结构域的RNA结合蛋白(YTH domain containing/YTH domain family, YTPDC/YTPDF)、核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNP)、真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3, eIF3)、脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)、胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins, IGF2BP)和富含脯氨酸卷曲螺旋蛋白2A (proline-rich coiled-coil 2A, PRRC2A)等。其主要功能包括与m6A甲基化区域的特异性结合、削弱与RNA阅读蛋白的同源性结合、改变RNA的二级结构以改变蛋白质与RNA的相互作用等[2]。

在哺乳动物中有5种含有YTH结构域的蛋白质：YTHDC1/2(DC1/2)和YTHDF1～3(DF1～3)，它们在C末端都有一个YTH结构域，能与m6A mRNA上的RRACH片段特异性结合，而其富含脯氨酸/谷氨酰胺/天冬酰胺(P/Q/N)的结构域与亚细胞定位有关。DC1识别位点主要在细胞核内，介导甲基化mRNA从核内向胞质中的输出，其基因敲除可导致核内m6A mRNA停留时间延长，转录产物在核内积累，并伴随胞质中的消耗；DC1可与剪接因子和核输出适配器蛋白SRSF3相互作用来调节mRNA的剪接。DC2识别位点主要在细胞质中，加速修饰后的mRNA降解，并促进相关蛋白的翻译；与其他广泛表达的YTH蛋白不同，DC2在生殖细胞中富集，DC2敲除的小鼠，生殖细胞发育缺陷，生殖器官小于正常小鼠。DF识别位点也在细胞质中，参与m6A mRNA降解阶段的液-液相分离；其中，DF2是第一个被发现的m6A结合蛋白，识别结合m6A mRNA，调节mRNA的稳定性，促进其降解；DF1与翻译起始因子和核糖体结合，而DF3与DF1协同作用，促进m6A mRNA的翻译[15]。

hnRNP是一组含有近30个分子质量的RNA结合蛋白，它们可以相互作用形成复合物，A1/2、B1/2、C1/2是主要组成部分；hnRNPA2/B1能够特异性识别m6A对mRNA的修饰[16]。hnRNPC负责识别m6A修饰基，并在核内介导mRNA前体的加工、剪接，影响靶基因的丰度和选择性剪接。m6A可增加RNA序列位点与核内不均一核糖核蛋白G (hnRNPG)结合的可及性；在转录本中，m6A调控RNA-hnRNPG相互作用，以影响靶mRNA表达和选择性剪接[17]。

此外，核糖体可作为m6A“读码器”，细菌的核糖体停留在m6A mRNA的密码子位点上，尽管哺乳动物的核糖体不同于细菌的核糖体，但有数据显示哺乳动物的核糖体也有在m6A位点处停滞的趋势[18]。IGF2BP和FMRP也可作为m6A“读码器”，它们似乎能增强m6A mRNA的翻译和稳定性。IGF2BP作为一个独特的m6A“读码器”，通过识别共有的GGC序列来靶向调控mRNA转录；与含有YTH结构域的蛋白相比，IGF2BP对m6A mRNA的亲和力较弱，对m6A mRNA和非甲基化mRNA的区分能力较差[19]。FMRP是一种选择性RNA结合蛋白，可与mRNA的m6A位点结合，并和DF2相互作用，通过DF2调控m6A mRNA靶点的稳定性[20]。在哺乳动物细胞中，eIF3是最大的真核起始因子，在真核翻译的起始过程中起关键作用，能直接与mRNA 5′UTR的m6A结合，从而促进mRNA的翻译[2]。PRRC2A也是新发现的m6A“读码器”，通过m6A与CDS区中的GGACU序列结合来稳定mRNA的表达，在少突胶质细胞的发育中起重要作用[21]。

3 甲基化与疾病

甲基化修饰正常存在，参与多种生物学过程的调控，而甲基化水平的异常则会引起生物功能的紊乱，进而引起相关的临床疾病。其中，m6A是甲基化中最为广泛和丰富的修饰，下面着重以m6A甲基化为例，从肿瘤疾病、代谢疾病、病毒感染、心脏和神经疾病等5个方面介绍与疾病的联系。

3.1 m6A与肿瘤疾病

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌的主要类型，发病率和病死率分别居全球第五位、第三位，其进展与m6A异常改变有关；METTL3上调或METTL14下调预示HCC患者预后不良，前者通过DF2促进HCC细胞增殖、迁移和集落形成，有助于HCC的进展；而METTL14则是一种抗转移因子，可抑制HCC细胞的转移，在HCC中显著下调，尤其是转移性HCC细胞，可导致m6A水平降低，进而增强HCC细胞的转移能力；DF1过表达也与HCC的进展有关，可能是HCC预后不良的新预测因子，它与HCC的病理分期呈正相关，随着HCC的分期升高而显著上调，还与5年生存率和无病生存率相关；WTAP在HCC中的表达也增加，促进HCC细胞在体内的增殖和成瘤能力，调节HCC细胞的细胞周期，进而促进HCC的进展。在中位生存期为5～8个月最具侵袭性的胰腺癌中，ALKBH5下调、DF2上调，促进肿瘤增殖；DF2可能是预测胰腺癌一种新的生物标志物，FTO则可促进胰腺导管腺癌的发生发展[22-23]。此外，胃癌(gastric carcinoma, GC)患者ALKBH5和FTO的表达明显下调，其m6A水平明显高于良性胃病患者和健康人，且随着GC的进展和转移而升高，GC患者术后m6A水平降低。而在结直肠癌中，DF1与其深度、淋巴结转移等有关，当DF1敲除时，对结直肠癌细胞的增殖有明显的抑制作用，DF1敲除的DC细胞则可产生抗肿瘤应答；DC2也能够促进结肠肿瘤转移[24-25]。

急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是最常见的血液系统恶性肿瘤之一，治疗难度较大，具有明显的遗传性。METTL3在AML干细胞和原发性AML患者样本中的含量明显高于人造血干细胞和其他肿瘤细胞，它介导的m6A升高在维持AML多能性和抑制骨髓细胞正常分化中起重要作用，激活癌基因导致AML的发生；若在AML干细胞中敲除METTL3则能诱导细胞分化和凋亡，延缓AML的进展。同样，METTL14也通过m6A修饰调节靶基因发挥致癌作用，它在AML细胞中高表达，是AML干细胞自我更新和维持所必需的，而敲除METTL4也能够抑制AML细胞的更新和增值。FTO也在AML中高表达，通过下调mRNA m6A甲基化水平而调控靶标蛋白的表达量，增强AML原癌基因介导的细胞转化和AML的形成。DF2也参与维持AML和AML干细胞自我更新。而RBM15则与儿童急性巨核细胞白血病(acute megakaryocytic leukemia, AMKL)有关，其表达可诱导和加速AMKL的发生[23]。

宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)是常见的妇科恶性肿瘤之一，约占90%以上；与相邻正常组织相比，CSCC组织中FTO表达显著升高，FTO通过降低m6A水平，可增强化疗抵抗力，而抑制FTO可增加CSCC的化疗敏感性；METTL3则可促进CSCC细胞的存活、增殖和侵袭。此外，与正常子宫内膜相比，约70%的子宫内膜癌显示m6A水平降低，可增强子宫内膜癌细胞的增殖和致瘤性，这是由于METTL14或METTL3表达减少所致。而乳腺癌在女性所有恶性肿瘤中发病率和病死率最高，低氧可诱导乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BCSC) ALKBH5的表达；ALKBH5降低mRNA中m6A水平，增强mRNA的稳定性，导致BCSC蛋白质水平增加，促进BCSC在低氧微环境中的富集和乳腺癌的发生，而缺乏ALKBH5则不利于BCSC富集和肿瘤发生；METTL3在乳腺癌的发生发展中呈强烈正相关，通过抑制肿瘤抑制因子进而加速乳腺癌的发展[23]。

肺腺癌患者的METTL3表达升高，可促进肺癌细胞的存活、增殖和侵袭，在肺癌中起到癌基因的作用；eIF3可与METTL3结合，也促进癌基因的翻译和癌变。前列腺癌患者的DF2显著上调，若敲除则可显著降低m6A水平，进而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移[23]。

3.2 m6A与代谢疾病

m6A甲基化可促进脂肪细胞葡萄糖氧化，适当水平的m6A可维持血糖稳定。胰岛素是人体内唯一能降低血糖的激素，由胰岛β细胞分泌，胰岛细胞尤其是β细胞的生物学调控在葡萄糖稳态中起着关键作用。m6A可通过调节基因表达来调节β细胞周期和胰岛素分泌，胰岛中的m6A mRNA减少可能影响胰岛素分泌的代谢途径，从而导致II型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。FTO介导的m6A水平下降与血糖有关，T2DM患者的胰岛中FTO表达增加且m6A水平显著降低，而高血糖则使FTO含量升高。而在T2DM患者的肝中，m6A水平和METTL3持续上调；METTL3可通过m6A甲基化抑制肝胰岛素敏感性，促进脂肪酸代谢；METTL3敲除可降低m6A水平，进而抑制脂肪酸代谢，脂肪酸合成减少，胰岛素敏感性提高[22]。

FTO普遍存在于脂肪和肌肉组织中，与人类体重增加和肥胖密切相关，FTO过表达的个体通常具有较高的体质指数(body mass index, BMI)；它通过去甲基化作用调节剪接位点周围m6A水平，调节脂肪生成调节因子的外源性剪接来控制脂肪细胞的分化，且调节能量稳态和多巴胺能途径，从而增强表达促进脂肪前体细胞的有丝分裂和脂肪的形成；m6A通过DF1增强翻译，提高蛋白水平，亦可促进脂肪生成；此外，WTAP、METTL3、METTL14也参与脂肪生成的调节，若敲除则可导致细胞周期停滞和脂肪生成受损。而肝三酰甘油积聚是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)最重要的特征，m6A mRNA在脂肪酸代谢、三酰甘油代谢等与脂质代谢相关的过程和途径中显著富集；肝脏中FTO过表达使得m6A水平降低，可致人类肝细胞中更多的脂质积聚，进而导致血脂异常和NAFLD；而METTL3过表达使得m6A含量升高，可抑制促脂肪基因的表达，从而抑制脂肪的生成并降低细胞三酰甘油含量[22]。

3.3 m6A与病毒感染

甲基化修饰与许多病毒感染密切相关，病毒感染后细胞核内ALKBH5水平显著增加，使得抗病毒效应分子mRNA发生去甲基化修饰，抑制了抗病毒效应分子蛋白的表达，从而降低干扰素产生，最终抑制抗病毒天然免疫应答反应；在感染后期，m6A可促进病毒蛋白在受感染细胞中的翻译。HIV-1病毒感染CD4淋巴细胞后(该细胞为艾滋病病毒的主要攻击对象)，不管是病毒自身mRNA，还是宿主细胞mRNA，都能促进其甲基化修饰；若敲除METTL3和METTL14，可使HIV-1的复制受到抑制，而敲除ALKBH5则促进HIV-1的复制；DF的3种蛋白都可识别并结合HIV-1 mRNA中m6A的修饰位点，在HIV-1病毒复制过程中发挥负调控作用，增强病毒mRNA的表达。同样，m6A甲基化不但影响寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)自身的转录，还影响宿主mRNA的结构和功能；m6A在ZIKV中水平升高，METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和DF等甲基化修饰相关酶与蛋白参与病毒复制的负调控；任意敲除DF三种中的单独一种，都可促进ZIKV的复制，且敲除DF2对病毒复制的促进作用最强；敲除ALKBH5能显著促进病毒复制，而敲除METTL14则抑制。当细胞感染Kaposi肉瘤病毒(kaposi’s sarcoma herpesvirus, KSHV)后，可促进m6A甲基化；当KSHV裂解宿主细胞时，m6A甲基化程度与细胞裂解程度呈成反比；敲除感染细胞中METTL3或DF，并使其分别感染正常细胞，发现病毒的复制受到抑制，并且病毒裂解反式激活因子也受到了抑制。此外，m6A mRNA甲基化也影响着丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的感染，其中METTL3、METTL14、FTO、DF等甲基化修饰相关酶与蛋白参与调控HCV感染[25]。

3.4 m6A与心脏疾病

FTO与心肌收缩力有关，心力衰竭(heart failure, HF)的心脏和缺氧心肌细胞中的FTO显著降低，m6A水平升高；FTO缺乏则会导致钙处理和肌节动力学异常，进而使得心肌细胞收缩功能丧失；m6A在心肌细胞增殖中也起着重要作用，METTL3与心肌细胞肥大有关，其在心脏中的水平升高可导致代偿性肥大，但不影响心功能，而敲除METTL3则可诱导偏心重塑，进而导致HF的形态学和功能体征。血脂异常和慢性炎性反应是冠心病(coronary heart disease, CHD)的重要危险因素，m6A通过调节脂质代谢和慢性炎性反应进而参与CHD的发生发展；FTO高表达可使患CHD的风险高出约20%，即使调整了BMI、血脂和血糖水平，FTO与CHD之间也存在着直接关联。此外，FTO还与肥厚型心肌病、室间隔缺损、房室缺损和心律失常等心脏疾病的发生有关[22]。

3.5 m6A与神经系统疾病

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是最致命的原发性脑肿瘤，胶质母细胞瘤干细胞(Glioblastoma stem cells, GSC)是一类具有促进GBM生长和侵袭能力的细胞，它的存在预示着GBM预后不良；m6A甲基化与GBM相关，敲除METTL3或METTL14，m6A水平降低，可明显促进GSC的增殖、自我更新并增强成瘤性，而敲除FTO则可抑制GSC的增殖与自我更新；ALKBH5在GSC中高表达，通过调控下游分子FOXM1来调控GSC的自我更新与成瘤能力，使m6A水平显著降低，可致GBM发生且预后不良[23]。同时，ALKBH5还与抑郁症相关，ZC3H13与精神分裂症相关，FTO则与注意缺陷/多动障碍、阿尔茨海默病、脑萎缩和抑郁症等多种神经系统疾病相关[24]。

此外，m6A甲基化通过对mRNA代谢的影响，还可控制昼夜节律、细胞增殖和存活的关键激酶，直接影响昼夜节律的长度，m6A的缺失则导致昼夜节律延长[25]。mRNA甲基化修饰的异常还可导致：不育、高血压、生长迟缓、发育停滞、面部畸形等情况[23]。

4 甲基化相关的检测技术

近年来，对mRNA甲基化修饰的研究越来越多，相应的检测技术繁多，如m6A基于抗体的检测有m6A-CLIP/IP、LAIC-seq等，基于消化的检测有SCARLET、LC-MS等，基于RT的检测有RT-KTQ聚合酶等，基于连接的检测有SELECT等，还有纳米通道和SMRT是直接基于RNA的检测。目前常用的方法有三种：1)液质联用质谱检测法，主要通过使用结合酶处理和离子打碎的方式，把核酸打碎成核苷和碱基，通过质谱谱图和峰值计算出m6A和总A的比例，从而得知m6A的整体水平；但该法无法将m6A修饰定量到具体是哪种RNA发生了修饰以及修饰的具体位置，并且操作较为复杂、价格较为昂贵、平台限制较强。2)光谱比色法，该法同质谱法相同的点在于：都是揭示样本m6A修饰总体水平，但更为简单易操作；其方法原理类似于蛋白的ELISA检测，将目标RNA同m6A抗体孵育，然后将孵育后液体转移至包被m6A的孔板中孵育、洗脱(只有和孔板中m6A结合的m6A抗体才能保留下来)，进行抗体信号生成反应，最后检测抗体信号；在整个实验过程中会使用到标准品的标准曲线进行精准定量，该法优点是目前市面上已有众多成熟的试剂盒，可直接购买随时使用，方法标准化、所需样本量少、操作简单、灵敏度高；但mRNA上m6A的定量容易受到含有m6A的rRNA和snRNA的干扰。3)高通量测序法(MeRIP-Seq)，主要是依赖于高通量测序仪对核苷酸序列实现序列组成测定的技术检测m6A修饰，其中应用最为热门的技术就是MeRIP-seq，其优点：1)针对全基因组范围内检测m6A的存在; 2)m6A的检测结果可以精确到基因，明确发生甲基化修饰的序列来源于哪个基因以及位置信息; 3)能够明确每个基因的修饰水平，进行组与组之间比较; 4)检测平台为测序仪，仪器限制低、通用性高、重复性好; 5)结果可以和其他组学联合分析，从多维度阐述机制; 6)实验操作简单、入门容易、所需样本量少。其缺点：1)无法区分m6A和m6Am; 2)RNA测序需要识别m6A位点，无法识别峰值内的多个m6A位点和具有单核苷酸分辨率的m6A位点; 3)假阳性风险高[2]。

5 问题与展望

mRNA甲基化修饰是目前比较新兴的领域，自2011年第一个m6A去甲基化酶发现以来，以m6A为代表的RNA表观转录学领域发展迅速。其中，m6A甲基化﹑m5C甲基化﹑m1A甲基化是mRNA甲基化修饰研究最多的三个方面，各种研究丰富了对mRNA甲基化修饰的认识。积极探究未知的mRNA甲基化修饰相关酶与蛋白、相关测序技术的创新与整合、如何更为简便快捷的检测mRNA甲基化修饰等都是大家比较关注的问题。同时，也越来越重视mRNA甲基化修饰与临床疾病的关联，寻找潜在的治疗靶点以利于更好地靶向治疗，不断研究开发相关酶与蛋白的抑制剂或激动剂以用于临床治疗，也是未来研究的重大问题。