4Rs原则在人体机能学动物实验中的应用

蔡维维，杜 斌，陈俊良，唐筛娣，邱丽颖

(江南大学无锡医学院 人体机能学实验中心， 江苏 无锡 214122)

4Rs原则是指在动物实验过程中用其他方法替代(replacement) 动物实验； 减少(reduction) 动物的使用数量；优化(refinement) 实验过程，减少动物痛苦；增强伦理观念，对实验动物要有责任感 (responsibility)。4Rs原则是美国芝加哥的伦理研究国际基金会在Russell 和Burch两位教授最早系统地提出了科学研究中动物实验的3Rs原则的基础上，增加了责任(responsibility)作为第4个原则，进一步构成了4Rs原则[1-3]。医学动物实验是机能学实验教学的基本途径和有效手段，其研究对发展生物医学和增进人类健康至关重要[4]。4Rs原则既没有完全否定动物实验的必要性，同时又强调了对实验动物生命的维护和尊重，是解决动物实验与伦理道德矛盾的可行依据。

将4Rs原则引入机能学实验教学，是培养医学生人文精神的重要内容，也是符合科学和伦理学发展方向[5]。近3年来，江南大学从2014、2015和2016级临床医学专业人体机能学系统整合课程建设着手，进一步探索4Rs原则在人体机能学动物实验教学中的应用。

1 资料与方法

1.1 对象

江南大学2014、2015和2016级临床医学(5年制)共93名学生，男生32人，女生61人。

1.2 方法

1.2.1 人体生理学实验替代动物实验：加强以人体为实验对象的研究以替代从动物实验中获取生理现象的研究与解释，使学生了解更多的与人体机能相关的知识。江南大学购置Web Chart-400人体生理学实验系统(成都泰盟)，极大丰富了人体生理学实验内容。根据课程建设及临床医学专业特点将人体生理学实验项目分为必修实验项目(6个)和选修实验项目(5个)。学生利用课外时间进行人体生理学选修实验项目实验，有效延伸课堂教学的内容(图 1)。

图1 人体生理实验项目Fig 1 Experimental project of Human physiology

1.2.2 整合实验项目，减少动物的使用数量：近年来通过整合实验项目数量，优化实验过程减少机能学实验动物的使用数量。将家兔基本技能操作(家兔麻醉:耳缘静脉注射、气管插管、分离颈动脉、迷走神经、减压神经、动脉插管和生物信号记录等)和家兔呼吸运动调节及药物作用(夹闭气管、刺激迷走神经和尼可刹米等)进行整合，可以使家兔的使用数量减半。将红细胞渗透脆性及影响血液凝固因素和离体小肠平滑肌生理特性及药物作用实验项目进行整合，可以使家兔的使用数量减半；实施方法为先将家兔颈动脉插管放血储存，用于红细胞渗透脆性及影响血液凝固因素实验；继续打开腹腔解剖回肠，用于离体小肠平滑肌生理特性及药物作用实验。将小鼠基本技能操作(标记编号、腹腔注射和灌胃等)、药物ED50(50% effective dose)的测定和药物镇痛作用实验项目进行整合；实施方法为药物ED50的测定和药物镇痛作用实验都需要标记编号、腹腔注射和灌胃，药物镇痛作用实验需要进行小鼠痛阈值筛选；痛阈不敏感的小鼠实行淘汰，可用于药物ED50的测定。将神经干动作电位测定(示教)、坐骨神经腓肠肌标本制备、骨骼肌收缩的影响和离体蛙心实验项目进行整合，达到减少蟾蜍的使用数量；实施方法为先进行动作电位测定(示教)、坐骨神经腓肠肌标本制备、骨骼肌收缩的影响实验项目，同时将解剖下来的离体蛙心用于另一个班级实验(图2)。整合实验项目不仅仅局限于机能学实验，可进一步拓展到生物化学实验，如收集失血性家兔的血液备用于凝胶层析法分离血红蛋白。

图2 整合实验项目数量Fig 2 Number of integrated experimental projects

1.2.3 优化实验过程，减少动物痛苦：以家兔肝性脑病模型建立为例，在实验方法改良前，家兔采用腹部切口局部麻醉进行肝叶结扎切除；家兔在手术过程前期表现恐惧、惊慌导致小便失禁等。通过优化实验过程改良实验方法，对家兔采用全身麻醉进行肝叶结扎切除；待家兔意识清醒后再采取氯化铵造模，同样能观察到家兔意识清醒状态下的全身抽搐的表现，以减少家兔的痛苦(图3)。通过课前的虚拟仿真实验、微课、视频等方法预习，避免实验操作失误，减少在实验过程中动物的痛苦。江南大学于2016年建立机能学虚拟仿真实验室，“虚实结合”用于机能学实验教学(图4)。将虚拟仿真实验项目作为实验课前预习实验基本要求，以便学生熟悉动物实验的目的、实验药品与设备、实验步骤、实验操作注意事项等，帮助学生树立“珍爱生命、换位思考”的观念。在实验过程中发现因实验流程和操作失误导致动物死亡，本组同学实验成绩记不及格，如乌拉坦耳缘静脉注射，因静脉推注过快导致家兔死亡；家兔气管插管不当导致气道堵塞家兔死亡； 家兔颈动脉插管因动脉打结不牢固至插管滑脱引起大出血至家兔死亡等。

图3 肝叶大部分结扎Fig 3 Mostly ligated of livers

图4 虚拟仿真实验项目Fig 4 Virtual simulation experiment project

1.2.4 增强伦理观念，对实验动物要有责任感：在机能学实验教学过程中通过实验室的实验动物慰灵牌(魂归自然、功留人间)对实验动物要有责任感，以加强医学生的伦理观教育(图5)。在机能学实验教学中，将动物伦理观融入到每一步实验操作中，如: 根据实验指导要求20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉家兔，因家兔体质存在个体差异而麻醉效果不同，进而需要在实验操作过程中根据家兔意识状态等多次适量补注麻醉药乌拉坦。家兔在实验过程中有痛苦挣扎或麻醉状态过浅，应停止实验操作，适量补注麻醉药乌拉坦。实验结束后准确地记录每只家兔乌拉坦使用的总量及家兔生命体征状况。

图5 实验动物慰灵牌Fig 5 Laboratory animal comfort card

1.2.5 实验教学效果调查问卷：为充分了解并评估学生针对人体机能学动物实验的教学需求，课后采用调查问卷的形式，收集学生对于4Rs原则实验教学的反馈意见，问卷包括以下几个问题: 1)实验动物福利与实验动物教学关系上，是否能做到以教学为主，同时兼顾到实验动物福利？选项为能做到、不能兼顾和有时可以有时不能说不清楚；2)在动物实验过程中是否同情实物动物？选项为同情、不同情和不知道很矛盾；3)在动物实验过程中是否有虐待实物动物的行为？选项为有和没有；4)看到身边同学有虐待实物动物的行为是否去阻止？选项为否和及时去阻止；5)实验动物的处死方法是否要彰显人道主义精神？选项为需要、不需要和不知道很矛盾；6)是否了解中国实验动物管理条例以及实验动物保护法律法规？选项为了解、一般了解和不了解。

1.3 统计学分析

发放纸质调查问卷，对数据进行分析，主要统计方法为描述性分析。

2 结果

发放问卷调查学生数为93人，发放问卷调查93份，收回问卷87份，回收比例为93.5%。问卷调查结果显示，92.0%医学生在动物实验过程中主动同情实验动物，积极主动做到以教学为主，同时兼顾到实验动物福利。100%医学生做到实验动物的处死方法要减少动物的痛苦，彰显人道主义精神(表1)。

表1 医学生对4Rs原则在动物实验中的认知

3 讨论

人文素质教育要遵循人的思想发展规律，“小火慢炖”、循序渐进， 让大学生人文素质教育融合、渗透到专业教学中去，具有重要意义[6]。在现实环境下，医学人文素质和医疗技术同等重要，医学生不仅要具备扎实的医疗技术，还要有丰富的人文底蕴[7]。4Rs原则与医学人文教学是一脉相承的，其目的是指通过替代而减少动物的使用并将动物的痛苦降到最低。在实验教学过程中逐步运用麻醉药物动物处死替代小鼠脱颈(脊髓)处死、大鼠断头处死、家兔静脉空气肺栓塞处死、家兔脑干锤击致死等。通过改进动物处死的方法来教育和感化医学生，提高学生们的思想认识和自我责任感，使学生们热爱医学、珍爱生命。规章制度是4Rs原则实施的根本保证，而规章制度的生命力在于执行。近年来，江南大学医学院动物实验中心逐步建设与完善其规章制度，如实验动物管理条例、动物福利伦理委员会、动物福利与伦理申请审查表、动物操作技术、麻醉、安乐死相关培训等。

目前，江南大学4Rs原则在机能学实验教学中还处于探索阶段，特别是通过整合实验项目，减少动物数量的使用。实验项目的整合需要考虑到理论课程各系统的关联性和教学进度。此外，问卷调查结果提示需要加强医学本科生对我国实验动物管理条例以及实验动物保护法律法规的学习教育。医学以人为对象，医生在重视医学科学本身的同时，也需要体现人性的关怀，而且这种人性关怀往往会起到不可或缺的作用[8]。因此，4Rs原则为医学人文教育的发展注入了新的生命力，为今后的人体机能学动物实验教学提供了新的思路与方法。