应用Illumina MiSeq测序技术对腹泻北平顶猴肠道菌群的分析

金 洁 张飞燕 张庆宇 王 芸 吕龙宝*

(1.中国科学院昆明动物研究所，昆明，650223；2.国家非人灵长类实验动物资源库，昆明，650223)

平顶猴(Macaca)是旧大陆猴中唯一易感艾滋病毒1型(HIV-1)的灵长类(Primates)动物[1]，其生理结构、机体代谢等方面与人类极为相似，是研究艾滋病病毒、新药临床前试验和安全评价的理想动物模型[2-3]。此外，由于平顶猴具有复杂而精细的神经活动和行为，也常常用于研究脑结构和功能。根据所在地域，平顶猴被划分为3个种：南平顶猴(M.nemestrina)、北平顶猴(M.leonina)和明打威猴(M.pagensis)，其中分布在中国的平顶猴被称为北平顶猴[4]。2012年，中国科学院昆明动物研究所在国内率先建成北平顶猴饲养繁殖基地，通过长期的临床病例统计分析发现，在北平顶猴消化道疾病中腹泻的发病率较高，约占10%，严重者可出现脱水，甚至休克。据报道，在临床上能引起腹泻的病因非常多且复杂，如：肠源性疾病[5]、内分泌疾病[6]、肿瘤[7]和抗生素[8]等，其共同的临床症状均包括肠道菌群失调。在健康动物体内，肠道菌群处于动态平衡中，与宿主协同进化互利共生，对维持宿主健康具有重要意义。当这种平衡被打破时，如：益生菌丰度减少、有害菌丰度大量繁殖，会造成各种炎症、肠胃疾病等，常出现腹泻症状。菌群失调可能是引起疾病的原因，或是疾病导致的结果。目前，对北平顶猴肠道菌群的研究尚未有报道。为了探究北平顶猴的肠道菌群结构及其腹泻过程中肠道菌群的失调规律，本研究对健康和腹泻北平顶猴的肠道菌群进行了对比分析，结合肠道微生态平衡的机理，揭示可能导致腹泻的菌群及其变化规律，为平顶猴腹泻治疗用药和益生菌制剂的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 粪便样品的采集

在中国科学院昆明动物研究所选取健康和腹泻雄性成年(5—10岁)北平顶猴各6只，分别采集其新鲜粪便于采粪管中，并将装有粪便的采粪管放入液氮罐中带回实验室。在超净台中取粪便内部分装，对健康样本编号H1—H6、腹泻样本编号D1—D6，所有样本均置于冰箱中-80℃冻存，准备送样测序。本试验中的12只北平顶猴均单笼饲养于普通环境，每只北平顶猴的粪便样品在排泄后10 min内完成收集。

1.2 细菌总DNA提取

使用MOBIO公司PowerFecalTMDNA试剂盒抽提12个粪便样本中细菌的总DNA，分别用质量浓度1%的琼脂糖凝胶电泳和Qubit 4仪器检测DNA质量。具体提取步骤按照说明书进行。

1.3 PCR扩增及高通量测序

PCR扩增及高通量测序工作由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。主要步骤如下：DNA质量合格后，用无菌水将其稀释至1 ng/μL，利用稀释后的总DNA为模板。使用特异引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)选取细菌16S rRNA V3—V4区进行扩增。扩增PCR产物合格后，根据产物浓度等量混样，并使用质量浓度2%的琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)纯化PCR产物，切胶回收目标条带。使用高通量建库试剂盒进行建库，构建好的文库经Qubit 4定量检测合格后，采用高通量测序平台Illumina HiSeq进行测序。

1.4 数据处理与分析

根据Barcode拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列得到原始数据。原始数据经FLASH拼接[9]、QIIME过滤[10]、Algorithm软件去除嵌合体后[11]，通过Overlap关系将Reads拼接成Tags，从而得到有效数据。在97%的一致性下将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units)。使用QIIME软件计算每个样品的Alpha多样性指数，包括Chao1指数、ACE指数以及Shannon指数；用R软件绘制稀释曲线、Rank abundance曲线；计算Unifrac距离，并利用OTUs的丰度信息得到weighted UniFrac距离[12]；同时通过PICRUSt菌群功能预测的方法评估北平顶猴肠道菌群的功能。各组数据组间差异的显著性均采用IBM SPSS Statistics 24软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 测序结果与OTU聚类

12个样本经测序后得到931 869条原始数据，通过拼接、质控和嵌合体过滤，共得到880 904条可用于后续分析的有效数据。在97%相似度下将所有样品的有效序列聚类为用于物种分类的OTU，如表1所示，健康组OTUs数大于腹泻组，且两组间差异显著(P=0.023)。

2.2 细菌群落丰富度和多样性

从图1A可以看出，稀释曲线在序列数为46 846条后趋向平坦，说明取样的数量合理，更多的取样量只会产生少量新OTUs。Rank abundance曲线反映样品中物种的丰富度和均匀度，如图1B所示，健康组样本的丰富度均高于腹泻组样本。基于以上两点，此次测序数据量合理，测序深度已基本覆盖样品中所有细菌。

Alpha多样性用于分析样品内的微生物群落多样性。其中，Shannon指数越大表明菌群多样性越强，Chao1指数和ACE指数越大表明样品中的物种越丰富。根据表1所示，健康组的细菌菌群多样性显著高于腹泻组(香农指数，P=0.015)，健康组的细菌菌群丰度显著高于腹泻组(Chao1指数，P=0.014；ACE指数，P=0.032)。此外，覆盖率(coverage)作为反映测序深度的指标，其值越接近于1，表明测序深度越能覆盖到样品中所有的物种。本试验中各组样本覆盖指数均大于0.99，说明样本中序列没有被测出的概率极低。

2.3 Beta多样性

Beta多样性组间差异分析中，weighted UniFrac距离常用来衡量样品间的物种多样性的差异，距离与样品间的物种多样性差异呈正比。与健康组比较，腹泻组的weighted UniFrac距离显著降低(P=0.036)，表明腹泻组与健康组在物种多样性方面存在显著性差异(图2A)。主成分分析(PCA)能将样本间的差异反映在二维坐标图上。样本的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。图2B显示，健康组和腹泻组分布在不同区域，表明健康平顶猴和腹泻平顶猴的肠道菌群组成存在一定差异。

2.4 门分类水平上的细菌组成

从门分类水平，按相对丰度前10作图(图3)。健康组的厚壁菌门(Firmicutes，54.89%)显著高于腹泻组(45.63%)，而拟杆菌门(Bacteroidetes，42.87%)明显低于腹泻组(49.11%)。此外，平均相对丰度高于1%的门，健康组有螺旋体门(Spirochaetes，1.67%)，腹泻组有变形菌门(Proteobacteria，1.33%)和未鉴定细菌(unidentified Bacteria，1.83%)。

2.5 属分类水平上的细菌组成

在属水平进行分析，按相对丰度平均值排名前10的菌属作图(图4)。健康组乳杆菌属(Lactobacillus，12.35%)、普氏菌属(Prevotella，5.23%)和未鉴定瘤胃球菌属(unidentified Ruminococcaceae，4.26%)的平均相对丰度明显高于腹泻组(3.57%，2.47%，3.40%)，而链球菌属(Streptococcus，5.72%)、粪杆菌属(Faecalibacterium，1.73%)和弯曲杆菌属(Campylobacter，0.74%)的相对丰度明显低于腹泻组(10.25%，4.82%，2.09%)。

2.6 PICRUSt基因预测

PICRUSt根据测序数据预测样品中的细菌功能类别相对丰度，获得的预测结果通过KEGG基因家族进行分类，结果显示健康组与腹泻组优势基因分区明显(图5)。共获得六大类功能(不包含未预测出的和未分类的)：细胞加工、环境信息处理、有机体系统、人类疾病、代谢作用、基因信息处理。基因功能预测热图(图6)表明，健康与腹泻组的基因功能存在一定差异，其中健康组的优势基因主要集中在与细胞加工、环境信息处理等功能方面，而腹泻组则主要集中在与有机体系统、人类疾病和代谢作用相关的方面。

3 讨论

本试验分别采集了6只健康和6只腹泻北平顶猴粪样，利用Illumina MiSeq高通量测序技术对2组北平顶猴的肠道菌群进行分析比较，获得稀释曲线趋于平坦，测序覆盖率已达99.99%，说明检测出的微生物群落已基本覆盖肠道内所有细菌。

健康组细菌的OTUs和Alpha多样性均显著高于腹泻组；Beta多样性分析显示，健康组和腹泻组的肠道菌群在物种多样性方面存在显著差异。揭示了北平顶猴发生腹泻可能与肠道内细菌总数的变化和菌群结构的多样性有关。

在门水平上，北平顶猴的优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门，与非人灵长类(Primates)动物肠道的优势菌群[13]相同，二者比例之和为70.50%—98.30%[14]。厚壁菌门可促进宿主吸收或储存能量，拟杆菌门可通过降解碳水化合物、蛋白质等，促进宿主吸收营养，平衡肠道微生态[15]。当肠内菌群失调，厚壁菌门相对丰度显著高于拟杆菌门时会导致食物中的热量更为有效地被吸收，从而引起肥胖[16-18]。北平顶猴腹泻组肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值低于健康组，可能是腹泻猴机体吸收能量较低所致。螺旋体门不仅能有效降解纤维素，还能利用碳水化合物形成挥发性脂肪酸，为动物机体提供能量[19]，健康组肠道内螺旋体门平均相对丰度高于腹泻组，进一步解释了健康动物精神状况较腹泻动物好的原因。变形菌门包括多种病原菌，例如：大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)等[20-21]，当肠内微生态失调，变形菌门相对丰度增加时常导致腹泻。先前有报道，在健康人类的肠道内变形菌门丰度较低，但某些致病因素会诱发其大量增殖，产生促炎因子，引起肠道炎症和腹泻[13]，因此本试验中腹泻组肠道内高丰度的变形菌门可能是导致北平顶猴发生腹泻的因素之一。另外，在平均相对丰度低于1%的门中，放线菌门的多数物种有益于人体或者对人体无害，其中双歧杆菌属(Bifidobacterium)通过生产醋酸盐和乳酸盐等调节肠道菌群[22]。腹泻组放线菌门的平均丰度低于健康组，可能是菌群失调所致。

在属水平上，乳杆菌属可通过产酸改变肠道微生态环境，抑制病原菌与肠黏膜上皮细胞黏附，阻碍其在肠道内定植、繁殖，减少疾病的发生[23-24]；普氏菌属善于合成维生素B1，可作为益生菌替代菌分解食物中的糖类[14]，普氏菌属与拟杆菌属的比值越高，可能越益于宿主的代谢调节[25]。本试验中腹泻组乳杆菌属和普氏菌属的平均相对丰度明显低于健康组，导致肠内益生菌减少、菌群失调，可能是诱导机体发生腹泻的病因之一。弯曲杆菌属是导致人类细菌性腹泻的主要原因，人感染该菌后主要表现为急性腹泻、发热、腹痛和伴有血便等症状[26]。本试验中腹泻组弯曲杆菌属的相对丰度较健康组高也是引发腹泻的因素之一。另外，某些链球菌属可导致炎症[27]，但本试验中链球菌属与腹泻发生的关系还有待进一步探究。

肠道微生物与机体的免疫功能、消化吸收、能量代谢和生理功能等有关[28]。人类肠道微生态稳态被破坏后可导致过敏[29]、肥胖和糖尿病[30]等。由此可见，肠道微生物平衡对于维持机体的正常生理功能具有重要作用。腹泻发生时，伴随机体营养物质大量流失、免疫力下降，易增加疾病发生的概率，机体需要通过调节自身生理功改善这一现象，基因预测也验证了这一结果：腹泻组功能基因主要与有机体、疾病和代谢相关。

4 小结

肠道菌群的平衡和失调是可逆的，本研究从微生态学角度对北平顶猴肠道菌群失衡与腹泻之间的关系进行了分析，以期为应用干预肠道微生态治疗北平顶猴腹泻提供实验数据。