陆地棉杯状叶突变体基因的SSR分子标记定位

陈旭升，赵龙飞，赵 亮，狄佳春

（江苏省农业科学院经济作物研究所/农业农村部长江下游棉花与油菜重点实验室，南京 210014）

0 引言

棉花叶片是棉株最主要的光合作用与蒸腾作用的场所，还具有储存光合产物与吸收外来营养物质的功能[1]，也是一种突变多发的器官。比如叶形突变体有鸡脚叶[2-3]、皱缩叶[4-7]、波状叶[8]与圆叶[9]；叶色突变体有花叶[10-11]、红叶[12]、亚红叶[13]与芽黄[14-16]；叶片茸毛突变体有多毛叶与光叶[17-18]等。合理利用叶片突变体可以扩充种质遗传基础，同时突变体也常被用来开展功能基因组研究[19]。

杯状叶(cup leaf)是一种比较古老的叶形突变体，它的叶片边缘向上卷，形状似杯子。1939年Yu[20]报道在亚洲棉‘小百花’品种中发现一种杯状叶突变体，株高正常，真叶很小时就呈杯状，叶边缘向上并向里卷曲。遗传研究表明，该杯状叶突变受一对完全隐性基因控制。1954年Lewis[21]报道在陆地棉‘Stoneville 2B’棉田里发现一棵杯状叶突变体棉株，苞叶略微卷曲，花瓣不能像正常棉花一样完全开放。遗传研究结果表明，该杯状叶是由一对隐性基因cu控制的质量性状，与正常叶杂交其F1表型呈中间型。Kohel[19-22]在一个陆地棉杯状叶材料中发现了超杯状叶的突变体，经过细胞学检测，该突变体是一个三体，通过易位杂交，鉴定出重复的染色体是A染色体组的第4号染色体，但遗传试验表明超杯状基因并不位于重复的第4号染色体上。

经典隐性遗传标准系T582含有5个隐性标记基因——芽黄(v1)、杯状叶(cu)、无腺体(gl1)、窄卷苞叶(fg)、丛生铃(cl1)，分别隶属5个连锁群[23]，其中杯状叶突变基因cu一直未被定位到特定的棉花染色体。直到2017年，Zhu等[24]通过集团分离加测序的技术(BSA-seq)将T582中的cu基因锚定到棉花chr.11。本研究依据在大田自主鉴定的一个绿色杯状叶突变系，对其进行表型特性的观察与遗传分析，并采用SSR分子标记对该突变基因进行分子定位，旨在为该突变体未来实际应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年利用自主发现的杯状叶突变系‘R169’，与海岛棉亲本‘胜利1号’杂交，得杂交F1。2016年种植F1，自交加代，得杂交F2群体。而后种植海陆杂交亲本以及杂交F1、F2群体，用于分析杯状叶突变基因的经典遗传学规律；并以海陆杂交F2作为定位群体，用于杯状叶基因的染色体定位，定位群体为110个单株。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片子DNA的提取 在大田取亲本以及杂交F1、F2的顶部嫩叶，采用Paterson等[25]的方法提取叶片DNA。

1.2.2 多态性标记筛选 使用的SSR引物序列均来自网站https://www.cottongen.org/。在F2代分离群体，选取正常叶单株10个，突变体杯状叶单株10个。然后用ScanDrop 250超微量核酸蛋白测定仪测定选取个体的DNA浓度，统一稀释成40 ng/μL后，吸取等体积的DNA溶液，构建近等基因混池。利用本实验室自主筛选获得的分布于棉花26对染色体上的234对核心引物[26-27]，对双亲以及近等基因混池进行PCR扩增，筛选多态性SSR引物。

1.2.3 突变基因的染色体定位 基因的染色体定位采用陈旭升等[28]研发的棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法。以海陆F2定位群体构建的近等基因混池，筛选获得具有多态性的引物，检测由隐性基因（杯状叶突变）混池的9个单株、P1(‘R169’)、P2（‘胜利1号’）以及F1共12个样本组成的小群体进行PCR扩增。经非变性PAGE凝胶电泳，通过银染染色逐一记录它们的带型。统计隐性混池的9个单株与隐性亲本P1的带型一致的个体数，计算拟合率。选出其中与P1带型一致，拟合率在60%以上的引物。然后用这些引物检测F2分离群体，统计带型，经JionMap 4.0软件分析，以快速锁定与突变基因连锁的目标SSR引物。

2 结果与分析

2.1 杯状叶突变体的鉴定

2013年在南京江苏省农科院棉花试验地（南京），在陆地棉种质系P003群体中，发现1棵淡棕絮突变株。2014年继续在南京试验地种植该突变株，在株行群体中发现有绿色杯状叶变异株，单株编号Q150-4-3（图1）。

图1 杯状叶突变株在大田的表型特征

2015年将杯状叶株Q150-4-3种植成株行，编号R169。在大田观察该株行群体的杯状叶纯度达100%。在开花期观察该绿色杯状叶株行的花瓣，其开放不完全，属于半闭花授粉（图2）。而后利用R169为杂交亲本，配制杂交组合，用于杯状叶突变性状的遗传规律分析。

图2 杯状叶突变体不同组织的表型特征

2.2 杯状叶突变体的遗传

取海陆杂交组合‘胜利1号’בR169’的杂交亲本及F1、F2群体的种子，采用营养钵苗床育苗，然后移栽大田种植。初花期在大田统计4个世代群体中叶形性状的分离情况见表1。由表中数据可知，母本‘胜利1号’全部个体均表现为正常叶形，父本‘R169’全部个体均表现为杯状叶形。F1代全部个体为正常叶形，F2代分离群体中正常叶形和杯状叶形的个体数目拟合3:1的分离比例。说明杯状叶突变体为单位点质量性状突变体，符合由一对隐性基因控制的孟德尔遗传分离规律，拟将其基因符号暂定为cup。

表1 ‘R169’和‘胜利1号’杂交后代的叶形分离情况

2.3 杯状叶突变体基因的染色体定位

在海陆杂交F2代分离群体，选取正常叶单株与突变体杯状叶单株的DNA，构建近等基因混池。利用234对分布于棉花26对染色体上的引物进行多态性筛选，共得到34对多态性引物。以这34对多态性引物进行PCR扩增，检测来自隐性基因（杯状叶突变）混池的9个单株、P1、P2以及F1共12个样本组成的小群体，统计其中隐性混池的9个单株与隐性亲本P1的扩增带型一致的个体数。结果显示，与P1带型一致率在60%以上的引物只有NAU3480、BNL1066，这2个引物就是与目的基因最大似然连锁引物。此后以这2个引物检测F2作图群体每个单株的标记基因型，通过Joinmap 4.0连锁软件分析显示引物NAU3480、BNL1066均与目的基因cup连锁：其中NAU3480与基因cup的遗传距离较近，为0.3 cM；引物BNL1066与基因cup的遗传距离较远，为11.3 cM。已知引物NAU3480、BNL1066均位于棉花第11染色体，据此推断该cup基因位于第11染色体。查阅棉花分子遗传图谱，合成位于第11染色体的110对引物，通过对双亲DNA的PCR扩增得到26对多态性引物。用这些引物检测F2代群体每个单株的标记基因型，然后通过软件进行遗传连锁分析，结果表明共有19对引物与基因cup连锁，它们分别是引物NAU5192、 NAU3621、 NAU2118、 NAU1162、NAU3409、NAU2998、NAU3657、NAU1148、NAU3234、NAU2651、NAU2599、NAU2661、NAU1014、NAU3622、BNL1408、NAU4086、BNL1066、NAU3480、NAU5505。基因cup位于SSR分子标记BNL1066与NAU3480之间，遗传距离分别为9.3 cM和1.6 cM。由此，杯状叶突变体基因被定位在棉花第11号染色体上，其连锁遗传图谱如图3所示。

图3 杯状叶突变体基因cup的连锁遗传图谱

3 结论与讨论

棉花经典遗传学对突变基因的定位方法，是使用显性遗传标准系T586和隐性遗传标准系T582，通过配置相关杂交组合，在杂交后代分析目标性状与已知标记基因的连锁关系。由于以上2个遗传标准系连锁的形态标记基因数太少，没有覆盖陆地棉所有染色体，因此其连锁定位成功的概率很低[27]。经典标准系T582具有cu基因，但一直未能定位在特定染色体上。直至2017年，Zhu等[24]基于集团分离与测序技术(BSA-seq)，将遗传标准系T582中的cu基因定位在棉花第11染色体上，但其锚定结果未见分子遗传图谱。本研究无需测序，利用SSR分子标记，通过本实验室自主研发的专利技术，快速将杯状叶突变基因定位在棉花第11染色体上，并绘制了SSR分子遗传图谱。至于本文定位的绿色杯状叶突变体基因cup与T582中呈现芽黄的杯状叶突变基因cu，是否属于同一突变体基因，尚有待进一步研究证实。

叶片适度卷曲有利于保持叶片挺立，提高光能利用率。前人试验结果表明，植物叶片的有效面积和厚度与光合速率呈正相关，同时较厚的叶片可以提高叶片的直立性，有利于密植，水稻高产品种往往把叶片的直立性作为其重要的选择指标[29]。在棉花中，杯状叶突变体叶片具有卷起直立的特点，有利于提高群体叶面积指数，对提升棉花群体的光合效能可能是有利的，在棉花株型育种中是一个值得特别关注的形态性状。