大孔吸附树脂吸附-解析古汉养生多糖工 艺 研 究*

钟 源，赵梦姣，彭栋梁，阳佑华，谢 康，李佳聪，刘 芳

（1.古汉中药有限公司，湖南 衡阳 421003；2.湖南省中药液体制剂工程技术研究中心，湖南 衡阳 421003）

多糖是由至少10个醛糖或酮糖通过苷键结合在一起的高分子碳水化合物，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物之一。多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗病毒等[1-5]药理作用，在医药及保健品研发领域有较多的研究与应用，当前已有黄芪多糖、香菇多糖注射液、紫芝多糖片等众多产品问世。

古汉养生多糖为古汉养生精醇沉工序中沉淀下来的混合粗多糖，其中包括黄精多糖、枸杞多糖、黄芪多糖、淫羊藿多糖、金樱子多糖等，干燥粉碎后呈棕褐色粉末，溶于热水、低浓度乙醇，在50%（V/V）以上的乙醇溶液中开始沉淀，在硫酸的作用下可水解，并迅速生成糖醛衍生物，加入苯酚即显橙黄色化。大量的研究已证实，上述多糖具有免疫调节、抗肿瘤等[6-9]功效。目前，古汉养生精产量大，年产醇沉粗多糖100吨以上，利用价值可观，将此部分粗多糖分离纯化、制剂成新产品可为企业带来巨大的经济效益。

目前，利用大孔树脂层析法去除粗多糖中的蛋白质、色素的研究较多，且效果较好。大孔树脂层析技术具有吸附量大、易解析、选择性好、重复利用等特点，在医药研究领域的应用越来越多，尤其在天然产物的提取、分离纯化方面的应用尤为突出，并逐渐显现出其优越性。近年来，NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100等树脂广泛应用于中药多糖的研究，分离纯化黄精多糖、枸杞多糖、甘草多糖的效果明显，显著优于其他树脂[10-12]。因此，本研究拟选用NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100、X-5、H103共7种大孔树脂层析法对古汉养生多糖进行吸附-解析实验，优化树脂吸附-解析工艺参数，以期为进一步分离纯化古汉养生多糖、开发高附加值产品提供前期基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 古汉养生醇沉粗多糖取自古汉中药有限公司口服液提取车间；D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B树脂（上海蓝季科技发展有限公司）；X-5、H103、NAK-20树脂（天津南开大学树脂有限公司）；葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，纯度≥99.8%，批号：110833-210908）；苯酚（湖南汇虹试剂有限公司，AR分析纯，批号：20190711），硫酸（衡阳市凯信化工试剂股份有限公司，AR分析纯，批号：20180605）；乙醇（湖南汇虹试剂有限公司，AR分析纯，批号：20191008）；Lambda35型紫外分光光度计（美国PerkinELmer公司）。

1.2 方 法

1.2.1 样品处理 车间取古汉养生醇沉粗多糖，回收酒精，60℃烘干至恒重，粉碎，密封保存待用。称取粗多糖粉末100 g，加水2 L，煮沸30 min，过滤，离心（3000 r/min，40 min），取上清液，定容至10 L，即为粗多糖溶液。试验中根据需要对粗多糖溶液进行稀释。

1.2.2 多糖检测[13]（苯酚—硫酸法）（1）标准曲线制作：精确称取无水葡萄糖对照品3.03 mg，置100 mL容量瓶中，加水适量溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置具塞试管中，分别加水补至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）样品多糖测定：精密量取试验样品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。精密量取多糖稀释样品2.0 mL，置具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，在490 nm波长处测定吸光度，计算多糖浓度。

1.2.3 树脂预处理及再生 新购买的D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B、X-5、H103、NAK-20树脂用水洗去除悬浮物及水溶性杂质后，乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，再以乙醇湿法装入玻璃层析柱，蒸馏水洗至流出液与水混合不浑浊，2% NaOH溶液浸泡4 h，蒸馏水洗至流出液呈中性，再用2%HCl溶液浸泡4 h，蒸馏水洗至流出液中性。

1.2.4 树脂静态吸附-解析试验 称取经预处理的7种树脂各10.0 g于100 mL的锥形瓶中，分别加入30 mL的粗多糖溶液，25℃恒温振摇24 h，振摇频率120 r/min。振摇结束之后，滤纸过滤粗多糖溶液，定容至50 mL，再稀释100倍，按“1.2.2”方法检测多糖浓度，计算各树脂多糖吸附率。

分离出来的树脂置于100 mL的锥形瓶中，加入30%（V/V）乙醇100 mL，25℃恒温振摇24 h，振摇频率120 r/min。振摇结束之后，滤纸过滤解析液，定容至50 mL，再稀释100倍，按“1.2.2”方法检测多糖浓度，计算各树脂多糖解析率。

吸附率（%）=[C1×V1/（C×V）×100%，解析率（%）]=[C2×V2/（CV-C1V1）]×100%。

式中，C、C1、C2分别为上样液（粗多糖溶液）多糖浓度，吸附之后的溶液多糖浓度，解析液多糖浓度；V、V1、V2分别为上样液体积，吸附之后的溶液定容体积，解析液定容体积。

1.2.5 树脂动态吸附-解析试验

1.2.5.1 上样浓度对树脂吸附效果的影响 量取经预处理的NAK-20树脂50 mL 4份，湿法装入4根玻璃层析柱内，分别以0.46、0.91、1.81、3.62 mg/mL的粗多糖溶液上样，上样流速3 BV/h（1 BV=50 mL），上样体积4 BV。按“1.2.2”方法检测流出液多糖浓度，计算树脂吸附量，确定最佳上样浓度。

1.2.5.2 上样体积对树脂吸附效果的影响 量取经预处理的NAK-20树脂50 mL，湿法装入玻璃层析柱内，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上样，上样流速3 BV/h，上样体积4 BV，依次收集流出液，每个样品50 mL。按“1.2.2”方法检测流出液样品的多糖浓度，确定最佳上样体积。

1.2.5.3 上样流速对树脂吸附效果的影响 量取经预处理的NAK-20树脂50 mL 3份，湿法装入3根玻璃层析柱内，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上样，上样体积2 BV，上样流速分别为1、2、3、4 BV/h，分别收集流出液。按“1.2.2”方法检测吸附流出液的多糖浓度，计算树脂吸附率，确定最佳上样流速。

1.2.5.4 解析溶液浓度对解析效果的影响 按实验“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”确定的NAK-20树脂吸附条件进行上样，进行4组试验，每组分别用4 BV的10%、20%、30%、40%（V/V）乙醇进行解析，解析流速2 BV/h，分别收集不同浓度乙醇解析下的解析液。按“1.2.2”方法检测吸附流出液和解析液的多糖浓度，计算多糖解析率，确定最佳解析液浓度。

1.2.5.5 解析溶液用量对解析效果的影响 按实验“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”确定的树脂吸附条件进行上样，再以10%（V/V）乙醇为解析液进行解析实验，解析体积4 BV，解析流速2 BV/h，每50 mL解析液收集为一个样品。按“1.2.2”方法检测吸附流出液和解析液样品的多糖浓度，计算多糖解析率，确定最佳解析液体积。

1.2.5.6 解析流速对解析效果的影响 按实验“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”确定的树脂吸附条件进行4根玻璃层析柱上样，再以10%（V/V）乙醇为解析溶液进行解析实验，解析流速分别为1、2、3、4 BV/h，解析体积均为2 BV。按“1.2.2”方法检测吸附流出液和各解析液的多糖浓度，计算多糖解析率，确定最佳解析流速。

1.2.5.7 验证实验 按实验“1.2.5.1”“1.2.5.6”确定的参数进行3次验证实验，检测吸附流出液和解析液的多糖浓度，计算NAK-20树脂对古汉养生精多糖的吸附率和解析率。

2 结果与分析

2.1 多糖标准曲线 见图1。

图1 多糖标准曲线

2.2 静态吸附-解析试验结果 见表1。

表1 7种大孔吸附树脂对古汉养生多糖静态吸附-解析的效果

由表1的数据可知，7种树脂中H103H和NAK-20对古汉养生多糖的静态吸附效果较好，吸附率分别为62.50%、66.76%，其中NAK-20的解析效果更好，解析率达到78.56%。因此，动态吸附-解析试验选用NAK-20树脂，优化NAK-20树脂吸附-解析古汉养生多糖工艺参数。

2.3 动态吸附-解析试验结果

2.3.1 上样浓度对树脂多糖吸附效果的影响 见图2。

图2 上样浓度对树脂吸附效果的影响

从图2可知，NAK-20树脂对古汉养生多糖的吸附量随着上样浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。上样浓度为1.81 mg/mL，吸附量达到8.35 mg/mL；当上样浓度再增加时，吸附量反而下降。因此，最佳上样浓度为1.81 mg/mL。

2.3.2 上样体积对树脂多糖吸附效果的影响 见图3。

图3 NAK-20树脂上样饱和曲线

图3所示，NAK-20树脂以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上样，随着上样体积的增加，流出液收集样品多糖浓度明显升高；当上样第3 BV时，收集样品多糖浓度已到达1.37 mg/mL，说明此时NAK-20树脂已达到吸附饱和。因此，NAK-20树脂吸附古汉养生多糖的最佳上样体积为2 BV。

2.3.3 上样流速对树脂多糖吸附效果的影响 见图4。

图4 上样流速对NAK-20树脂吸附效果的影响

树脂吸附上样流速过快，目标组分可能来不及吸附就流出；流速过慢，杂质竞争性吸附可能较强，同时吸附效率不高，不利于工业化大生产。图4所示，随着上样流速的增大，NAK-20树脂吸附率先增大后降低，流速为3 BV/h时，吸附效果最佳，达到79.05%。因此，NAK-20树脂吸附古汉养生多糖的最佳上样流速为2.5 BV/h。

2.3.4 解析液浓度对多糖解析效果的影响 见图5。

图5 解析溶液乙醇浓度对多糖解析效果的影响

多糖一般在30%以下的乙醇或热水中溶解较好，柱层析中常用30%及以下的乙醇作为解析剂，能取得很好的解析效果[14-15]。动态试验对比研究了10%、20%、30%、40%乙醇的解析效果，如图5所示，随着乙醇浓度的增大，多糖解析率逐渐降低，4 BV 10%乙醇解析多糖解析率能达到81.38%，证明以10%乙醇为解析溶液解析效果较好。

2.3.5 解析溶液用量对多糖解析效果的影响 见图6。

图6 解析溶液用量对多糖解析效果的影响

图6所示，随着解析溶液用量的增加，古汉养生多糖解析率增大。当解析溶液用量为2 BV时，解析率达到79.03%，再增加解析溶液用量解析率变化不明显，考虑到经济效益，故选择解析溶液用量为2 BV。

2.3.6 解析流速对多糖解析效果的影响 见图7。

解析流速（BV/h）图7 解析流速对古汉养生多糖解析效果的影响

解析流速太慢，树脂对多糖的竞争性吸附作用较大，不利于多糖解析下来；流速过快，多糖还来不及被解析下来，解析溶液已流出。从图7的趋势可以看出，随着解析流速的增大，古汉养生多糖解析率呈现先升高后降低的趋势，当解析流速为2 BV/h，解析率达到85.38%，解析效果最好。

2.4 验证实验结果 按照实验“2.3”确定的NAK-20树脂吸附-解析工艺参数进行3次重复实验，NAK-20树脂对古汉养生多糖的吸附率分别为68.94%、67.77%、70.01%，解析率分别为86.23%、82.36%、85.88%，平均吸附率和解析率分别为68.91%、84.82%。实验证明，NAK-20树脂对古汉养生多糖的吸附-解析效果较好，工艺参数稳定。

3 小 结

古汉养生多糖为复合纯中药多糖类物质，其中含有淫羊藿多糖、黄精多糖、枸杞多糖等。多糖结构复杂。目前多糖定量分析方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，笔者采用苯酚-硫酸法对多糖含量进行检测，利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，该化合物在490 nm波长处有特征吸收。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地通过物理吸附水溶液中的有机物。实验选用了NAK-20等7种大孔吸附树脂对醇沉粗多糖进行研究吸附-解析研究，在静态吸附试验筛选树脂的基础上，对NAK-20树脂的动态吸附-解析试验进行了工艺参数优化，得到的最佳工艺参数为：上样液多糖浓度1.81 mg/mL，上样体积2 BV，上样流速3 BV/h；解析溶液为10%乙醇，解析溶液用量2 BV，解析流速2 BV/h。吸附率和解析率分别达到68.91%、84.82%，效果较好。

实验未对古汉养生精多糖中蛋白质、色素等杂质的脱除情况进行考察，多糖纯度未进行深入分析，这是本研究存在的不足之处，也是后期研究的方向。利用现代分离纯化技术提高古汉养生多糖的纯度，并以此开发保健食品、药品等，能达到变废为宝、提升企业经济效益的目的。