外周血ctDNA中KRAS/BRAF基因突变检测在晚期结直肠癌中的临床价值*

冯 芬

广东省佛山市第一人民医院胃肠肿瘤内科 528000

结直肠癌是临床常见的一种异质性疾病，是第三大起源于上皮组织的恶性肿瘤，在中国，结直肠癌的发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第三位和第四位，严重威胁患者生命安全[1]。近年来，结直肠癌的发病率以3.9%/年的速度急剧增加，且呈现出年轻化趋势[2]。目前，临床针对结直肠癌的筛查尚缺乏有效手段，且疾病早期无特异性临床表现，因而多数患者首次确诊时便已经处于晚期，甚至已经伴有远处转移[3]。已有研究显示，针对晚期结直肠癌，常规化疗方案的治疗效果欠佳[4]。随着结直肠癌中越来越多的基因位点被认识，相应的靶点抑制剂也显示了有效性好、安全性高及患者依从性高的优点[5]。西妥昔单抗是一种靶向表皮生长因子受体的分子靶向药物，已获批用于晚期结直肠癌的一线治疗。相关研究发现，对于KRAS/BRAF野生型晚期结直肠癌患者，西妥昔单抗联合化疗的治疗效果较为明显，患者的生存时间得到显著延长；但是随着靶向治疗时间的延长，不可避免地出现了获得性耐药现象，因而已成为临床急需解决的一项难题[6]。近年来，深入研究发现，KRAS和BRAF基因在结直肠癌获得性耐药、疾病进展等方面具有重要作用。因而本研究为了进一步研究可以高效、快捷、稳定且动态地监测获得性耐药的机制，通过循环肿瘤DNA(ctDNA)对结直肠癌患者的KRAS和BRAF基因突变情况进行检测，并对其临床意义进行探讨，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2020年6月本院收治的晚期结直肠癌患者50例为研究对象，其中男27例(54.0%)，女23例(46.0%)；年龄35～64岁，平均年龄(49.6±5.2)岁；有淋巴结转移21例(42.0%)，无淋巴结转移29例(58.0%)。纳入标准：(1)经病理检查确诊为晚期结直肠癌，临床分期为Ⅲb～Ⅳ期，组织学类型为腺癌；(2)原发性结直肠癌；(3)经电子计算机断层扫描具有可测量病灶；(4)接受至少2个周期的西妥昔单抗联合化疗治疗，且至少进行1次评估；(5)肿瘤组织基因检测为KRAS-WT和BRAF-WT。排除标准：(1)合并其他部位恶性肿瘤；(2)合并严重心、肝和肾功能不全；(3)任何曾经接受或正在接受放化疗、靶向治疗或生物治疗；入组前3个月内接受过输血；无法提供基因检测样本(外周血)；合并已知的免疫缺陷病史(如HIV感染史)和/或丙型肝炎等传染病史。

1.2 治疗方法 所有患者均接受西妥昔单抗联合化疗方案进行治疗，具体方法：第1天，奥沙利铂130mg/m2，静脉滴注；第1～14天，卡培他滨900mg/m2，口服，每3周为1个疗程。在化疗前1d，接受西妥昔单抗注射液治疗，初始剂量400mg/m2，静脉输注2h；之后每周维持剂量为250mg/m2，静脉输注1h，每3周为1个疗程。治疗结束后1个月，采用实体瘤疗效评价标准(RECIST 1.1)[7]对所有患者的治疗效果进行评价，分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展。客观缓解率=(完全缓解+部分缓解)例数/总例数×100%，疾病控制率=(完全缓解+部分缓解+疾病稳定)例数/总例数×100%。

1.3 外周血ctDNA和组织标本中KRAS和BRAF基因突变检测 血液样本：采集患者的清晨空腹静脉血8～10ml置于EDTA抗凝管中，在室温下置于离心机上，以2 000r/min的转速离心10min，分离患者血浆。取分离得到的血浆样本(上清液)，手动抽提其中的DNA，采用NanoDrop 2000核酸定量测定仪对抽提得到的血浆样本中的DNA进行定量分析；在荧光定量PCR仪上按照突变扩增阻滞系统法对外周血ctDNA中的KRAS和BRAF基因突变情况进行检测，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。组织标本：收集患者的肿瘤组织和癌旁组织样本，采用QIAamp FFPE Tissue Kit(Qiagen)抽提肿瘤组织样本中的基因组DNA。KRAS和BRAF基因突变情况检测与上述血液样本的检测方法相同。突变结果判定：基因突变含量>1%，突变Ct值≥29时，判定为基因突变阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件处理所得数据。计数资料以例数和百分比(%)表示，采用χ2检验进行组间比较；采用Kaplan-Meier法进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.3 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突变与晚期结直肠癌患者临床特征的关系 年龄≥50岁、有淋巴结转移的晚期结直肠癌患者的KRAS、BRAF基因突变率高于年龄<50岁、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特征结直肠癌患者外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突变率比较[ n(%)]

表2 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突变和未突变患者的疗效情况[ n(%)]

2.5 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突变与晚期结直肠癌患者预后(中位无进展生存期)的关系 外周血ctDNA中KRAS基因突变患者的中位无进展生存时间为10.30个月(95%CI：8.383～12.217)，KRAS基因未突变患者的中位无进展生存时间为11.30个月(95%CI：9.779～12.822)，KRAS基因未突变患者的生存情况优于KRAS基因突变患者，差异有统计学意义(Log-Rank=4.351，P=0.037)，见图1。

图1 KRAS基因突变和KRAS基因未突变患者的中位无进展生存曲线

外周血ctDNA中BRAF基因突变患者的中位无进展生存时间为8.10个月(95%CI：5.051～11.149)，BRAF基因未突变患者的中位无进展生存时间为11.10个月(95%CI：10.403～11.797)，BRAF基因未突变患者的生存情况优于BRAF基因突变患者，差异有统计学意义(Log-Rank=8.143，P=0.004)，见图2。

图2 BRAF基因突变和BRAF基因未突变患者的中位无进展生存曲线

3 讨论

结直肠癌的发生、进展是一个多基因参与的复杂过程，随着手术、化疗、放疗及联合疗法的不断改善，结直肠癌患者的治疗效果及预后都得到了很大提升，但是对于晚期结直肠癌，尤其伴有远处转移的患者，疗效仍较差[8]。西妥昔单抗是临床常用的治疗结直肠癌的靶向药物，且在晚期患者中显示出了较好的治疗效果，使结直肠癌的临床治疗进入了靶向治疗时代[9]。已有研究表明，下游基因如KRAS、BRAF基因的状态，可以影响西妥昔单抗治疗的疗效[10]。相关研究指出，KRAS/BRAF野生型晚期结直肠癌患者可以从西妥昔单抗治疗中获益，但KRAS/BRAF突变型患者却获益较小甚至无获益[11-12]。因而，联合检测KRAS和BRAF基因对预测西妥昔单抗在晚期结直肠癌中的疗效具有重要意义。

ctDNA是来源于肿瘤细胞的游离DNA，是细胞坏死或凋亡后释放至外周血的DNA[13]。相关研究显示，与健康人群相比，肿瘤患者外周血ctDNA水平显著增高，且与肿瘤组织具有一致性[14]。本研究结果显示，50例晚期结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、BRAF基因突变率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；但肿瘤组织中KRAS、BRAF基因突变率均与外周血ctDNA相似，差异无统计学意义(P>0.05)，与相关研究结果一致[15]。提示外周血ctDNA与肿瘤组织的一致性较好，临床可以通过动态监测外周血ctDNA中的KRAS、BRAF基因突变情况，对患者的治疗和预后进行合理调整和有效评估。本研究还发现，年龄较大，有淋巴结转移的晚期结直肠癌患者的KRAS、BRAF基因突变率较高，且KRAS、BRAF基因未突变患者的治疗效果和预后均优于KRAS、BRAF基因突变患者。提示KRAS、BRAF野生型患者可以更好地从西妥昔单抗中获益。但由于本研究的样本量较小，因而尚需进一步扩大样本量进行深入研究。

综上所述，外周血ctDNA与肿瘤组织的一致性较好，在临床上无法获取肿瘤组织标本时可行外周血ctDNA替代，且可以通过动态监测外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突变情况对晚期结直肠癌患者的疗效和预后情况进行评估，进而有助于临床医师为患者选择个体化治疗方案，改善患者预后。