响应面法优化微波提取毛竹叶黄酮工艺研究

许子竞

（ 贵州工程应用技术学院 化学工程学院 天然产物中心， 贵州 毕节 551700）

毛竹（Phyllostachys pubescens） ， 又叫楠竹， 属多年生常绿植物， 在我国栽培历史悠久， 主要分布在我国长江以南的丘陵和山麓地区及山村房前屋后。楠竹材质坚韧、 富弹性、 篾性优良， 在传统应用中，主要用于建筑、 农用、 家具制作和生活用品等。 近年来， 随着制药工业和食品加工技术的发展， 科研工作人员对毛竹叶资源有了更深层次的研究和认识。研究表明， 毛竹叶含有黄酮、 茶多酚、 酚酸、 多糖等活性化学成分[1-3]， 其中毛竹叶中总黄酮含量较高，达2%左右[4-5]。 毛竹叶黄酮具有抗氧化、 抗衰老、 防辐射、 抗癌变、 增强免疫力、 降血脂和胆固醇、 抗动脉硬化及抑菌等多种生理功能[6-8]。

从毛竹叶中提取竹叶黄酮， 目前很多企业和一些科研单位， 仍然采用传统提取技术- 溶剂浸提加外循环提取技术， 但这类提取工艺技术存在对原料利用率低、 过程操作单元多、 能耗高、 提取过程产生大量的废水和废渣、 严重污染环境等缺点， 妨碍了毛竹叶总黄酮的高效开发。

近年来， 由于微波辅助提取技术在药品和食品工业的逐步兴起， 微波辅助提取高效和快速的新技术， 解决了传统提取耗时和环境污染的问题， 并且由于微波提取技术成本低、 自动化程度高、 操作性强的特点， 使其较传统提取工艺优势更为明显[9]。 因此， 试验利用单因素试验和响应面法相结合， 采用微波辅助提取， 对毛竹叶黄酮的提取工艺进行优化，旨在为竹叶黄酮能更合理地开发和利用， 提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

两年生毛竹叶， 贵州赤化集团提供； 乙醇、 三氯化铝、 硫酸亚铁、 水杨酸、 过氧化氢、 焦性没食子酸、 分析纯； 蒸馏水， 实验室自制； 芦丁， 上海同田生物技术股份有限公司提供。

JA-1003B 型电子天平， 上海越平科学仪器制造有限公司产品； 旋转蒸发仪， 上海沃珑仪器有限公司产品； 真空冷冻干燥机， 上海豫明仪器有限公司产品； TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计， 北京普析通用仪器有限责任公司产品； 微波提取器（3 kW，20 L）， 天水华源微波设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 毛竹叶黄酮的提取工艺

将毛竹叶晾干、 粉碎后， 准确称取试验用量样品， 用3.0 kW 功率的微波提取器提取， 按工艺要求， 加入体积分数为80%的乙醇， 设置工艺要求的料液比、 提取温度和提取时间， 每批料提取3 次，随后合并提取液， 将滤液离心过滤、 浓缩、 冷冻干燥， 得干燥试验样品， 供检测使用[10-11]。

1.2.2 单因素试验

分别考查料液比（1∶9， 1∶12， 1∶15， 1∶18，1∶21， 1∶24， 1∶27） 、 提 取 时 间（ 8， 11， 14，17， 20， 23， 26 min）、 提取温度（55， 60， 65， 70，75， 80， 85 ℃） 对毛竹叶黄酮提取含量和提取率的影响。

1.2.3 响应面试验

根据1.2.2 的试验因素进行Box-behnken 试验设计， 以竹叶黄酮提取率为响应值（ Y） ， 以料液比（A） 、 提取温度（B） 、 提取时间（C） 为变量因素，进行响应面优化。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

根据响应面设计要求， 分别对料液比、 提取温度和提取时间进行变换： 设A=（ Z1-21）/6， B=（ Z2-75）/10， C=（ Z3-20）/3， 以A， B， C 为变量因素， 竹叶黄酮提取率（Y） 为响应值， 通过Box-behnken 试验设计方案。

1.2.4 竹叶黄酮含量测定

（1） 芦丁标准曲线的制作。 参照赵振等人[11]标准曲线制作方法： 准确称取芦丁标品5 mg， 放置于25 mL的容量瓶中， 加甲醇溶解， 配制成0.2 mg/mL 质量浓度母液， 从母液中分别移取0， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0，1.2， 1.6 mL 置于10 mL 的容量瓶中， 移取0.1 mol/L三氯化铝溶液2 mL 加入上述各容量瓶中， 加入甲醇定容， 室温下放置15 min， 供测定吸光度用。

（2） 毛竹叶黄酮含量的计算。

式中： M——粗总黄酮百分含量， %；

V0——取样后定容体积， mL；

V1——样品溶解后定容体积， mL；

V2——移取样品体积， mL；

A——测定的吸光度；

m——称取的样品质量， g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

芦丁波长扫描图见图1， 芦丁标准曲线图见图2， 三氯化铝对照的紫外吸收图见图3。

图1 芦丁波长扫描图

图2 芦丁标准曲线图

图3 三氯化铝对照的紫外吸收图

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对竹叶黄酮提取率的影响

料液比对竹叶黄酮提取率的影响见图4。

图4 料液比对竹叶黄酮提取率的影响

由图4 可知， 固定提取温度75 ℃， 提取时间20 min， 料液比从1∶9（g∶mL） 增到1∶21（ g∶mL）， 黄酮提取率由2.35 %提高到5.63%， 随后料液比从1∶21（ g∶mL） 达到1∶27（ g∶mL） 时， 黄酮提取率开始略有下降， 可能是由于溶剂量增加，引起提取物浓度稀释， 进而使试验检测结果偏低。因此， 料液比选择1∶21（g∶mL） 较为适宜。

2.2.2 提取时间对竹叶黄酮提取率的影响

提取时间对竹叶黄酮提取率的影响见图5。

图5 提取时间对竹叶黄酮提取率的影响

由图5 可知， 固定提取温度75 ℃， 料液比1∶21（g∶mL） ， 提取时间从8 min 增加到20 min， 黄酮提取率从1.20%上升到5.44%， 随着提取时间的延续， 黄酮含量略有下降， 可能是由于其他类物质提取的增多， 引起黄酮含量下降， 影响提取率。 因此，提取时间选择20 min 较为适宜。

2.2.3 提取温度对竹叶黄酮提取率的影响

提取温度对竹叶黄酮提取率的影响见图6。

由图6 可知， 固定提取时间20 min， 料液比1∶21（ g∶mL） ， 温度从55 ℃到75 ℃， 黄酮含量从1.98%到5.29%， 然后， 随着温度的升高， 黄酮含量略有下降， 可能是随着提取温度的升高， 水溶性杂质也增多， 引起黄酮含量质量分数降低， 造成提取率下降。 因此， 最佳提取温度为75 ℃。

低温配制工艺对虎杖膏中总二苯乙烯和总蒽醌含量的影响…………………………………………………… 王玉和等（21）：2911

图6 提取温度对竹叶黄酮提取率的影响

2.3 响应面优化竹叶黄酮提取工艺

2.3.1 响应面试验

在2.2 单因素试验的基础上， 根据Box-behnken设计进行试验。

Box-behnken 设计方案与试验结果见表2， 回归模型的分析结果见表3。

表2 Box-behnken 设计方案与试验结果

利用SAS 软件进行各因素经回归拟合后， 得到毛竹叶黄酮提取率对料液比、 提取温度和提取时间的二次多项回归方程为：

对表3 进行显著性和方差分析， 该回归方程（ F=40.25， p＜0.01） 极显著： 相关系数R2=0.986 4，说明模型可信度在98.64%以上。 失拟项（ F=6.87，p=0.129 8＞0.05） 不显著， 说明该模型拟合情况较好， 受其他因素影响较小。 回归方程中一次项A、 B对竹 叶黄酮提取率极显著（ p＜0.01） ， C 显著（ p＜0.05） ； 二次项A2、 B2、 C2对竹叶黄酮提取率极显著（ p＜0.01） ， 交叉项AB、 AC、 BC， （ p＞0.05） 不显著。 从方差分析因素F 值大小（FB＞FA＞FC） 可知，因素影响的主次顺序为提取温度＞料液比＞提取时间， 综上分析， 说明该响应面模型有效， 可靠性好。依据模拟方程， 求偏微分， 得A=0.443， B=0.644，C=0.25， 代 入A=（ Z1-21）/6， B=（ Z2-75）/10， C=（ Z3-20）/3， 得Z1=23.656， Z2=81.44， Z2=20.75。

表3 回归模型的分析结果

2.3.2 交叉作用分析

提取时间和提取温度相互作用的等高线图见图7， 提取时间和料液比相互作用的等高线图见图8，提取温度和料液比相互作用的等高线图见图9。

图7 提取时间和提取温度相互作用的等高线图

从3D 曲面进行三因素交互作用分析， 由图7～图9 可知， 得到3D 响应曲面为开口向下的凸形曲面， 说明响应值存在极高值。 由图7 可知， 在料液比达一定值时， 提取时间和提取温度相互作用较强，在提取温度75 ℃和提取时间20 min 左右时， 竹叶黄酮提取率存在提取极值点； 由图8 可知， 在提取时间一定时， 提取温度和料液比相互作用较强， 在料液比1∶21（g∶mL） 和温度75 ℃左右时， 竹叶黄酮提取率存在提取极值点； 由图9 可知， 在提取温度一定时， 料液比和提取时间相互作用较强， 在提取时间20 min 和料液比1∶21（g∶mL） 左右时，相互作用较强， 竹叶黄酮提取率存在提取极值点。

2.3.3 验证试验

将单因素最佳工艺参数进行3 次平行验证试验，与模拟方程模型相比， 将最佳单因素修正为料液比1∶24（g∶mL）， 提取温度81 ℃， 提取时间21 min，竹叶黄酮的最佳提取率为5.78%。

3 结论

以两年生毛竹叶为原料， 在固定微波功率3.0 kW和80%乙醇条件下提取黄酮， 研究提取温度、 提取时间和料液比3 个因素对毛竹叶黄酮提取的影响，并用响应面对毛竹叶黄酮提取工艺参数进行优化，并以芦丁为对照品， 以三氯化铝对芦丁紫外吸收峰红移原理测定黄酮含量。 结果表明， 黄酮最佳提取工艺为料液比1∶24（g∶mL）， 提取温度81 ℃， 提取时间21 min， 在此条件下， 黄酮的提取率为5.78%，与响应面理论预测值5.81%相比， 其相对误差为0.51%。 说明该模型可靠， 可以用来指导提取毛竹叶黄酮， 为开发毛竹叶有效成分的利用， 提供了一定的理论依据。